編譯：微科盟coco，編輯：微科盟Tracy、江舜堯。
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導讀
目的： 探討紅景天苷（Sal）改善帕金森病（PD）認知功能的潛在機制。
方法： 實驗小鼠分為對照組、模型組[註射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）]和模型+Sal（低濃度、高濃度）組。我們提取小鼠海馬組織進行RNA測序，獲得核心通路和核心基因。我們制備了小鼠血漿並用LC-MS分析以獲得差異代謝物，透過免疫熒光和慢病毒轉導驗證體外實驗。
結果： ELISA顯示Sal有助於減少小鼠的神經元損傷和炎癥反應。MPTP_Sal_Low和MPTP_Sal_High組的膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）表達水平較高。轉錄組學鑒定出對照組、MPTP組和MPTP_Sal_High組的差異表達基因（DEG），歸類於絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）訊號通路，獲得核心基因Braf。代謝組學顯示差異代謝物涉及DL-酪胺酸、腺苷、磷酸烯醇丙酮酸和L-色胺酸。體外實驗驗證Sal處理抑制了p-p38、p-c-Jun N末端激酶（JNK）和p-細胞外訊號調節激酶（ERK）表達的上調，以及神經元突起的生長。Braf過表達（OE-Braf）組GDNF表達顯著上調，p-p38、p-JNK和p-ERK表達降低，神經元突起顯著生長。
結論： Sal可能透過Braf介導的MAPK訊號通路發揮對PD的作用，從而增加GDNF的表達，促進神經元突起的生長，保護神經功能，改善認知功能。
亮點：
1.紅景天苷有利於減輕神經元損傷，改善認知功能。
2.紅景天苷有利於減輕炎癥反應。
3.紅景天苷增加海馬GDNF和BDNF的表達。
4.紅景天苷促進神經元突起的生長。
5.紅景天苷可能透過抑制Braf介導的MAPK訊號通路來改善PD。
論文ID
原名： Salidroside improves cognitive function in Parkinson’s disease via Braf-mediated mitogen‑activated protein kinase signaling pathway
譯名： 紅景天苷透過Braf介導的絲裂原活化蛋白激酶訊號通路改善帕金森病的認知功能
期刊： Biomedicine & Pharmacotherapy
IF： 6.9
發表時間： 2024.06
通訊作者： 耿德勤，高殿帥
通訊作者單位： 南京醫科大學
實驗設計
實驗結果
1. Sal改善小鼠運動協調性
本研究使用的樣品梯度洗脫程式如表1所示。整個分析過程中，樣品均置於4℃的自動進樣器中。21d桿測試顯示，模型組轉身時間和爬下時間明顯高於對照組（P < 0.05）。與模型組相比，MPTP_Sal_Low組和MPTP_Sal_High組的轉身時間和爬下時間明顯縮短（P < 0.05）（圖1A-B）。
表1 梯度洗脫程式
圖1 爬桿實驗評估小鼠運動協調能力。(A)轉身時間；(B)爬下時間。註：#代表與對照組相比，P < 0.05；*代表與模型組相比，P < 0.05。
2. Sal促進小鼠學習記憶能力
Morris水迷宮測試顯示，與對照組相比，模型組的路徑長度和逃逸潛伏期明顯延長（P < 0.05）。與模型組相比，MPTP_Sal_Low和MPTP_Sal_High組的路徑長度明顯縮短（P < 0.05）（圖2A-B）。對照組和MPTP_Sal_High組小鼠到達平台的路徑最短，而Model組小鼠到達平台的路徑最長且最復雜（圖2C）。
圖2 Morris水迷宮測試對小鼠學習記憶能力的評估。（A）路徑長度；（B）逃逸潛伏期；（C）小鼠遊泳路徑。註：#表示與對照組比較，P < 0.05；*表示與模型組比較，P < 0.05。
3. Sal改善小鼠神經元損傷和炎癥反應
與對照組相比，模型組的Tau、TNF-α和IL-6水平顯著升高（P < 0.05）。與模型組相比，MPTP_Sal_Low和MPTP_Sal_High組的Tau、TNF-α和IL-6水平顯著降低（P < 0.05）。四組Syn水平比較無統計學差異（P > 0.05）（圖3A-D）。
圖3 ELISA檢測小鼠海馬神經退行性疾病指標及炎癥因子。（A）Tau；（B）Syn；（C）TNF-α；（D）IL-6。註：#表示與對照組比較，P < 0.05；*表示與Model組比較，P < 0.05。
4. Sal增加海馬GDNF和BDNF表達
免疫熒光結果顯示，模型組與對照組相比，GDNF和BDNF表達明顯降低。與Model組相比，MPTP_Sal_Low和MPTP_Sal_High組具有較高的GDNF和BDNF表達水平。（圖4A-B）。
圖4 免疫熒光檢測海馬GDNF和BDNF表達。（A）GDNF（10×40，20μm）；（B）BDNF（10×40，20μm）。
5. 生物資訊學分析後得到核心通路和核心基因
我們分析對照組和MPTP組之間的差異，得到177個上調基因和612個下調基因（圖5A）；分析對照組和MPTP_Sal_High組之間的差異，得到491個上調基因和2301個下調基因（圖5B）；分析MPTP組和MPTP_Sal_High組之間的差異，得到379個上調基因和830個下調基因（圖5C）。
圖5 透過生物資訊學分析辨識核心通路和核心基因。(A) 火山圖顯示對照組和MPTP組的DEGs；(B) 火山圖顯示對照組和MPTP_Sal_High組的DEGs；(C) 火山圖顯示MPTP組和MPTP_Sal_High組的DEGs；(D)透過各比較組DEGs聯集得到3424個動態基因；(E) 動態布局和基因數量；(F) GO term富集分析的細胞成分；(G) GO term富集分析的分子功能；(H) GO term富集分析的生物學過程；(I) DEGs顯著富集的訊號通路；(J) 透過MAPK訊號通路基因與關鍵模組基因交集得到7個核心基因；(K) 組間基因表現。
隨後，我們對各比較組的DEGs的聯集進行趨勢分析，動態基因總數為3424個（圖5D）。DEGs被分為8個不同的動態模組，由於本研究更關註那些經Sal處理後表現出連續變化的基因，因此重點關註了profile 0，共有135個基因（圖5E）。對該動態中的DEGs進行了GO term富集分析。DEGs在神經元投射、細胞核和核質等細胞成分中富集（圖5F）；分子功能的變化主要集中在轉錄調控活性和轉錄順式調控區結合上（圖5G）。GO term富集分析表明DEGs與生物過程有關，例如調節細胞過程和細胞生物合成過程（圖5H）。隨後我們對核心模組進行KEGG富集分析，篩選出DEGs顯著富集的訊號通路，發現DEGs與MAPK訊號通路、多巴胺能突觸、軸突再生、膽堿能突觸相關（圖5I）。
本研究篩選出與神經系統疾病相關的核心通路：MAPK訊號通路，透過KEGG資料庫獲得MAPK訊號通路內267個基因。我們將MAPK訊號通路基因與核心模組基因進行交集，得到7個核心基因（圖5J）。對比不同實驗組間目的基因表現差異，我們發現Control組、MPTP組和MPTP_Sal_High組Braf、Prkacb、Srf、Cacnb4、Fos、Prkx基因表現存在差異（P < 0.05）（圖5K）。在此基礎上，Braf被選定為後續研究的核心基因。
6. 代謝組學鑒定核心代謝物
正離子模式下，與對照組相比，MPTP組有36種代謝物表達上調，255種代謝物表達下調（圖6A）。與對照組相比，MPTP_Sal_High組有63種代謝物表達上調，233種代謝物表達下調（圖6B）。與MPTP組相比，MPTP_Sal_High組有140種代謝物表達上調，53種代謝物表達下調（圖6C）。負離子模式下，與對照組相比，MPTP組有49種代謝物表達上調，277種代謝物表達下調（圖6D）。與對照組相比，MPTP_Sal_High組有65種代謝物表達上調，269種代謝物表達下調（圖6E）；與MPTP組相比，MPTP_Sal_High組有130種代謝物表達上調，90種代謝物表達下調（圖6F）。
圖6 透過代謝組學鑒定核心代謝物。(A) 正離子模式下對照組和MPTP組之間的 DM 火山圖；(B) 正離子模式下對照組和MPTP_Sal_High組之間的DM火山圖；(C) 負離子模式下MPTP組和MPTP_Sal_High組之間的DM火山圖；(D) 負離子模式下對照組和 MPTP 組之間的 DM 火山圖；(E) 負離子模式下對照組和 MPTP_Sal_High 組之間的 DM 火山圖；(F) 負離子模式下MPTP 組和 MPTP_Sal_High 組之間的 DM 火山圖；(G) 正離子模式下的動態布局和基因數量；(H) 正離子模式下 DM 顯著富集的途徑；(I)負離子模式下基因的動態布局和數量；(J)負離子模式下DMs顯著富集的途徑。
正離子模式下Trend_Cont_MPTP_SAL_High_MPTP分析結果顯示，動態代謝物總數為2129種，我們篩選出1573種代謝物，得到556種DM。DM被分為8個不同的趨勢模組（圖6G），由於本研究更關註Sal處理後具有連續變化的代謝物，因此重點關註profile 0，共計82個代謝物。DM顯著富集的通路共有8條（表2）。本研究篩選出了與神經系統疾病相關的核心通路：帕金森病，該通路的DM涉及DL-酪胺酸和腺苷（圖6H）。
表2 正離子模式下DM顯著富集的通路
負離子模式下Trend_Cont_MPTP_SAL_High_MPTP分析結果顯示趨勢代謝物總數為1850個，篩選出1396種代謝物，得到454種DM。DM被分為8個不同的趨勢模組（圖6I），由於本研究更關註Sal處理後代謝物連續動態變化的情況，因此重點關註profile 0，共60種代謝物。有4條通路顯著富集DM（表3）。本研究篩選出了與神經系統疾病相關的核心通路：苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸的生物合成，該通路的DM涉及磷酸烯醇式丙酮酸和L-色胺酸（圖6J）。
表3 負離子模式下DM顯著富集的通路
7. 轉錄組學和代謝組學的關聯分析
將DEGs和DMs富集通路進行交集得到一條訊號通路，即酒精中毒（圖7A）。該通路的DEGs包括Braf、Prkacb、Gnb3和Sos1，DMs包括腺苷和DL-酪胺酸。熱圖展示了轉錄組的基因表現以及代謝組學的代謝物豐度（圖7B）。與對照組相比，MPTP組的Braf、Prkacb、Gnb3和Sos1下調，而與MPTP組相比，MPTP_Sal_High組的Braf、Prkacb、Gnb3和Sos1上調。此外，與MPTP組相比，MPTP_Sal_High組的腺苷和DL-酪胺酸積累較多。
圖7 轉錄組學和代謝組學的關聯分析。（A）DEGs富集通路和DMs富集通路Venn圖；（B）基因表現與代謝物含量的整合圖。
8. 體外實驗驗證Sal對神經元突起生長的影響
免疫熒光檢測顯示大部份培養細胞呈GFAP陽性，說明培養細胞為星形膠質細胞。綠色代表GFAP陽性細胞，藍色代表DAPI與細胞核結合。細胞爬片時，星形膠質細胞明顯，呈梭形，GFAP表達主要位於胞漿和突起處。本實驗中95%以上的星形膠質細胞為陽性反應，符合實驗要求（圖8A）。
圖8 體外實驗鑒定Sal對神經元突起生長的影響。（A）免疫熒光檢測GFAP表達（10×40，20μm）；（B）免疫熒光檢測神經元突起長度（10×40，20μm）；（C）ELISA檢測GDNF表達；（D）免疫熒光檢測GDNF表達（10×40，20μm）；（E）免疫熒光檢測p-p38表達（10×40，20μm）；（F）免疫熒光檢測p-JNK表達（10×40，20μm）；（G）免疫熒光檢測p-ERK表達（10×40，20μm）。註：#表示與對照組比較，P < 0.05；*表示與MPTP組比較，P < 0.05。
免疫熒光檢測結果顯示，MAP2在免疫熒光下被染成綠色，可見神經元胞體和突起，MPTP組突起長度較對照組短，MPTP+Sal組和MPTP+Sal+SB203580組神經元突起較MPTP組明顯增多（圖8B）。
ELISA檢測結果顯示，與對照組相比，MPTP組GDNF水平明顯降低（P < 0.05），與MPTP組相比，MPTP+Sal組和MPTP+Sal+SB203580組GDNF水平明顯升高（P < 0.05）（圖8C）。
免疫熒光檢測顯示MPTP組與對照組相比GDNF水平降低，而MPTP+Sal組和MPTP+Sal+SB203580組與MPTP組相比GDNF水平升高（圖8D）。
MPTP啟用星形膠質細胞MAPK訊號通路，p-p38、p-JNK、p-ERK表達上調。此外，SB203580處理降低了p-p38、p-JNK、p-ERK表達，Sal處理抑制了p-p38、p-JNK、p-ERK表達上調（圖8E-G）。
另外，我們構建了慢病毒載體，慢病毒過表達載體轉導後Braf mRNA表達明顯增強，Braf表達明顯高於NC組（圖9A-B）；免疫熒光結果顯示OE-Braf組較NC組神經元突起明顯增多（圖9C）；免疫熒光結果顯示OE-Braf組GDNF表達明顯上調（圖9D）；與NC組相比，OE-Braf組p-p38、p-JNK、p-ERK表達降低（圖9E-G）。
圖9 Braf 過表達對神經元突起生長的影響。（A）qPCR檢測NC和OE-Braf組Braf mRNA表達；（B）免疫熒光檢測NC和OE-Braf組Braf表達（10×40，20 μm）；（C）免疫熒光檢測NC和OE-Braf組神經元突起長度（10×40，20 μm）；（D）NC和OE-Braf組GDNF表達（10×40，20 μm）；（E）免疫熒光檢測NC和OE-Braf組p-p38表達（10×40，20 μm）；（F）免疫熒光檢測NC和OE-Braf組p-JNK表達（10×40，20 μm）；(G)免疫熒光檢測NC組和OE-Braf組p-ERK表達(10×40,20μm)。註：△表示與NC組比較，P<0.05。
討論
PD在中老年人中較為常見，但在50歲以下人群中相對少見，其主要病理改變為黑質致密部多巴胺能（DA）神經元變性遺失，黑質-紋狀體DA含量降低，路易氏體大量聚集，膽堿能系統相對亢進。目前，PD的發病機制尚不明確，臨床上普遍認為與氧化應激、粒線體衰竭、神經炎癥、神經老化等有關。PD患者出現認知功能障礙的風險隨著年齡增長而增加。研究證實，PD患者輕度認知障礙的患病率約為20%–40%，且PD患者發生癡呆的機率隨病程延長而增加，發病早期約為3%–30%，發病20年後可達80%以上。目前，采用有效的方案緩解PD患者的認知障礙已成為研究熱點。
Sal是從中藥紅景天中提取的苯乙醇化合物，不僅能促進血腦屏障的修復、抑制炎癥因子的釋放，還有很強的神經保護作用。Wu等研究發現Sal透過影響6-羥基多巴胺在帕金森病大鼠的神經毒性來對抗氧化應激損傷，這種作用可能與Wnt/β-catenin訊號通路有關。Li等研究發現Sal對帕金森病具有重要的神經保護作用，其主要透過調控與氧化應激相關的粒線體MEF2D-ND6通路來保護DA神經元。Liang等從大鼠獲取海馬組織發現Sal有利於乙酰膽堿含量和丙二醛活性的增加，能夠抑制過度的炎癥反應，減輕氧化應激，調節膽堿能系統，從而改善大鼠的認知功能。本研究構建了PD小鼠模型，並透過行為學實驗進行觀察，發現MPTP誘導的小鼠模型對爬桿能力有不良影響，降低空間學習記憶功能，而不同濃度的Sal可改善小鼠的運動協調能力，有利於提高其學習記憶能力。此外，Tau和Syn參與了細胞骨架組織破壞、軸突運輸缺陷、神經元功能障礙等過程，Tau和Syn水平的變化被認為是PD患者認知功能下降的病理基礎。炎癥在PD的發病過程中也起著一定的作用，Sal已被用於幹預膿毒癥性腦病小鼠，我們發現其TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低，丙二醛含量降低，LPS誘導的海馬自噬增強，從而起到神經保護作用。本研究發現，與對照組相比，模型組Tau、TNF-α、IL-6水平明顯升高，提示帕金森病小鼠神經元受損，炎癥反應加重，而Sal有利於減輕小鼠神經元損傷，降低炎癥反應，改善認知功能。本研究闡明Sal對帕金森病小鼠行為障礙有改善作用，對多巴胺能神經元有保護作用，其可能機制之一是Sal促進Tau及炎癥因子的清除。
當大腦的認知功能受損時，海馬、大腦皮層等前腦結構通常會受到損害。海馬形成功能障礙與多種神經退行性疾病密切相關。神經營養因子包括神經生長因子、BDNF和GDNF。其中，GDNF在基底神經節、嗅結節等DA神經元投射區域，Meynert基底核、三叉神經運動核等與某些運動有關的神經結構，以及丘腦、三叉神經感覺核等與某些感覺有關的結構都有相當多的mRNA表達。有研究已證實GDNF可對PD小鼠發揮神經營養作用，促進DA能神經元的正常發育和功能。Conway等人的研究表明，GDNF 可以特異性地促進 DA 能神經元的存活，促進 DA 能神經元的形態分化，促進神經元對DA的攝取，推測GDNF/RET 訊號可作為治療PD的一種方法。血清GDNF可能與PD合並認知障礙患者的註意力、記憶力和執行功能受損有關，無論是透過其單獨作用還是與神經傳導物質（HVA、5-HT、GABA 和 Ach）聯合作用。本研究的免疫熒光結果顯示，模型組的GDNF和BDNF表達明顯低於對照組。與模型組相比，MPTP_Sal_Low 組和 MPTP_Sal_High 組的GDNF和 BDNF 表達水平較高。這一發現與Liu等人的研究結果基本一致。研究發現，Sal 可能透過調節細胞生長並與軸突再生相關的神經營養因子 (BDNF、GDNF) 發揮治療作用。
本研究采用生物資訊學技術探討Sal治療帕金森病的作用機制，有效辨識了Sal幹預所調控的基因。我們對對照組、MPTP組、MPTP_Sal_High組的DEGs聯集進行趨勢分析，將DEGs分為8個不同的趨勢模組。KEGG富集分析顯示，DEGs主要富集在MAPK訊號通路、多巴胺能突觸、軸突再生、膽堿能突觸等通路。其中，MAPK訊號通路是與神經系統疾病相關的核心通路，MAPK是一組絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶，是訊息傳遞網路的重要組成部份，MAPK訊號通路參與神經元的存活與雕亡，與神經損傷、神經可塑性調控密切相關。有研究者構建了PD和DAergic神經元損傷模型，發現抑制p38 MAPK訊號通路可降低炎癥介質水平，體外實驗也證實特異性p38抑制劑SB203580可增強抗炎作用。BDNF透過與原肌球蛋白相關激酶B（TrkB）受體結合，使TrkB磷酸化，從而啟用MAPK/ERK通路，進而對精神分裂癥、艾爾茨海默病、PD等疾病產生影響。Ahmed等已得出結論，ERK1/2、JNK和p38作為MAPK訊號通路的關鍵組成部份，在細胞增殖、分化和雕亡中發揮關鍵作用，參與神經生長、神經保護和神經營養等神經活動，從而影響與年齡相關的神經退行性疾病的發病率。隨後，本研究從MAPK訊號通路基因與關鍵模組基因的交集出發，獲得與神經功能相關的核心基因Braf。Braf編碼一種參與MAPK訊號通路組成的絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶。研究證實，在帕金森病患者中，Braf在該通路中富集，Braf在神經元中的失調及其對神經膠質細胞的影響可能促使神經退行性疾病的發生。因此，本研究推測Sal治療帕金森病的作用機制可能透過調控MAPK訊號通路和神經功能相關基因的表達來促進神經元生長。
代謝組學的特點對中醫藥治療機制分析具有良好的作用。本研究在正負離子模式下，篩選出了與神經系統疾病、帕金森病及苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸生物合成相關的核心通路，以及該通路的調控因子DL-酪胺酸、腺苷、磷酸烯醇丙酮酸和L-色胺酸。代謝組學結果顯示，Sal可能透過調節能量代謝和胺基酸代謝發揮帕金森病的治療作用。研究表明，苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸作為芳香族胺基酸，可引起神經系統改變，芳香族胺基酸代謝異常可能是帕金森病發病的重要機制。有學者發現帕金森病患者血漿或腦脊液中的代謝物譜發生改變，其中酪胺酸和色胺酸等胺基酸可作為潛在的生物標誌物。在帕金森病的發生過程中，粒線體功能障礙，代謝模式發生改變。腺苷是ATP的主要代謝產物，來源於ATP的去磷酸化，在中樞神經系統中起神經傳導物質的作用，具有神經保護和抗炎訊號傳導作用。磷酸烯醇丙酮酸是糖解作用和糖原生成的中間產物。Bergau等人已證明，艾爾茨海默病患者和非艾爾茨海默病患者腦脊液中的糖解作用代謝產物存在差異，艾爾茨海默病患者的磷酸烯醇丙酮酸顯著降低。為了研究Sal對疾病相關基因和代謝物的影響，本研究進行了轉錄組學和代謝組學的關聯分析。結果顯示，與MPTP組相比，MPTP_Sal_High組中Braf、Prkacb、Gnb3、Sos1表達上調，腺苷和DL-酪胺酸在MPTP_Sal_High組中積累。我們推斷Sal治療可能透過影響PD相關DEGs的表達和DMs的含量發揮作用。腺苷已被證實與PD的發病有關，由於腺苷在突觸後分布較多，在突觸前分布較少，因此可以減少突觸前各種神經傳導物質刺激的釋放，調節神經元活動，從而起到負反饋調節的作用。腺苷A2A受體（A2AR）可以調控蒼白球和內側前額葉皮質神經元的工作記憶。苯丙胺酸在苯丙胺酸羥化酶的作用下轉化為L-酪胺酸，酪胺酸在酪胺酸羥化酶（TH）的作用下轉化為左旋多巴，左旋多巴在芳香族胺基酸脫羧酶的作用下脫羧為DA。帕金森病患者中苯丙胺酸代謝的改變會影響酪胺酸代謝物的合成，並伴有TH失活，從而產生一系列的異常改變。此外，Braf與神經系統疾病核心通路的代謝物存在相關性。Luebker等人報道，Braf抑制劑耐藥的LM-MEL-28細胞的KEGG通路基因集富集檢測到糖解作用/葡萄糖新生、脂肪酸代謝、纈胺酸/白胺酸/異白胺酸降解、丙酮酸代謝和色胺酸代謝的下降。有研究人員建議透過使用 3-巰基丙酸靶向抑制磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 1 來克服黑色素瘤對 b-raf 抑制劑的化學耐藥性。Young的研究結果表明，抑制 BRAF 和 MEK 與 A2A 腺苷受體相結合，可顯著防止小鼠腫瘤發生和轉移形成，靶向腺苷可增強接受靶向或免疫治療的 Braf 突變黑色素瘤患者的治療反應。
此外，本研究還透過體外實驗驗證了Sal對神經元突起生長的影響。首先我們分離了小鼠皮質星形膠質細胞，並用GFAP免疫熒光進行鑒定。結果發現，與模型組相比，Sal治療能夠提高GDNF水平，SB203580治療後GDNF水平也顯著升高。這一發現表明Sal透過促進GDNF的神經營養支持對多巴胺能神經元發揮保護作用，而p38 MAPK訊號通路的抑制有助於GDNF水平的升高。MAPK訊號通路通常由p38、JNK和ERK檢測。當脊髓神經元和星形膠質細胞受損時，p38、JNK和ERK表達增加，進而啟用一系列與炎癥相關的下遊訊號通路。在本研究中，MPTP啟用了星形膠質細胞MAPK訊號通路，p-p38、p-JNK和p-ERK表達上調。SB203580 治療能夠降低 p-p38、p-JNK 和 p-ERK 表達，而Sal 治療可抑制 p-p38、p-JNK 和 p-ERK 表達的上調。人們認為 Sal 可能透過促進 GDNF 表達和抑制 MPTP 啟用的星形膠質細胞中的 MAPK 訊號通路發揮神經保護作用。Qi 等人已證實 Sal 濃度依賴性地抑制 pO2 誘導的 PC12 細胞雕亡，減弱 p38、JNK和 ERK 的磷酸化，並抑制活性氧的釋放，從而發揮神經保護作用。Zhang等人有報道指出Sal透過下調促雕亡蛋白Bax、上調抗雕亡蛋白Bcl-X(L)來保護神經元免受氧化應激，並能抑制JNK和p38 MAPK的磷酸化，但不能顯著抑制ERK1/2，由於本研究樣本量小，組內樣本差異大，與本研究結果略有不同。需要說明的是，我們的研究僅關註MAPK訊號通路，而Sal可能有多種調控機制，本研究不能排除Sal透過其他通路或機制影響神經元。Sal參與的訊號通路在PD中的作用已被許多學者報道。Zhang等對PD細胞焦亡的機制及Sal的神經保護作用進行了研究，發現Sal透過抑制TXNIP/NLRP3/caspase-1訊號通路直接抑制細胞焦亡，保護多巴胺能神經元。Chen等報道稱，Sal 誘導的對 PD模型神經元的保護的潛在機制可能涉及自噬的保留，自噬主要透過 mTOR/p70S6K 訊號傳導減弱神經元中 α-syn 的磷酸化。Shen 等人報道，在體內，Sal 治療可以降低 PD 小鼠黑質中丙二醛和鐵的含量；在體外，SAL治療可以增加TH、GPX4和Nrf2的表達和粒線體膜電位，同時透過 Nrf2/GPX4通路減輕PD中的鐵死亡。Zhang等人得出結論，Sal可以部份調節 PI3K/Akt/GSK3β 通路，以防止 MPTP 誘導的細胞雕亡和多巴胺能神經元的遺失。以上研究證實Sal可能透過不同的訊號通路調控細胞焦亡、自噬、鐵死亡和雕亡，從而在帕金森病的發生開發中發揮作用。與以往報道不同，本研究表明Sal透過MAPK訊號通路調控GDNF表達，影響神經元突起生長，從而表現出減輕帕金森病的作用，但具體機制還有待進一步探討。此外，神經元突起的縮短或缺失是導致神經退行性疾病的基本病理特征，突觸可塑性是中樞神經系統再生的重要組成部份，在認知功能的調控中起著不可替代的作用。我們透過MAP2免疫熒光染色探討了Sal對神經元軸突生長的影響，結果表明在Sal幹預的同時加入MAPK訊號通路抑制劑可以顯著增加神經元突起。為了觀察Sal對神經元突起生長的作用，我們在Sal幹預的同時加入了p38 MAPK抑制劑，結果發現與單獨使用Sal相比，Sal與Sb203580聯合使用對GDNF表達和神經元突起生長的增加有更好的正向作用，這說明MAPK訊號通路是Sal發揮神經保護作用的靶點。最後，我們對Braf慢病毒感染星形膠質細胞後GDNF表達和神經元突起生長的變化進行了初步探討。結果發現，OE-Braf組GDNF表達水平明顯上調，p-p38、p-JNK、p-ERK表達降低，神經元突起明顯增多。結果提示，星形膠質細胞感染Braf慢病毒後，其內在生物學行為發生了改變。Braf上調可能誘導星形膠質細胞分泌GDNF，從而促進神經元生長，這與MAPK訊號通路活性下調有關。本實驗為後續研究Braf過表達星形膠質細胞在PD中的作用奠定了基礎，但其詳細的調控機制仍需進一步研究。
綜上所述，Sal可能透過Braf介導的MAPK訊號通路對PD產生影響，增加GDNF的表達，促進神經元突起的生長，從而保護神經功能，改善認知功能。本研究的局限性在於我們只對profile 0中包含的DEGs和代謝物感興趣，但在未來的研究中，還需要關註profile 7中的其他DEGs和代謝物。此外，作者初步討論了Braf慢病毒感染星形膠質細胞後GDNF表達和神經元突起生長的變化。由於研究範圍較窄等因素，本研究未對MPTP和MPTP+Sal樣品進行Braf慢病毒感染。因此，可以考慮擴大研究範圍以獲得更準確的結果。未來還需要更多的實驗來進一步探究Sal對PD的治療機制。
