编译：微科盟公虾米，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读
安化黑茶(DTs)，包括天尖茶、千两茶、黑砖茶和茯砖茶，是中国安化县独特的发酵茶；然而，它们的化学成分差异仍不清楚。本研究采用代谢组学、挥发组学和电子感官评价等方法，对5种安化DTs的化学成分和感官特性进行了分析比较。所有这些茶都源自相同的茶原料。安化DTs之间的化学成分差异显著，其中天尖茶差异最大。长期发酵和复杂的加工方法导致多种化合物的转化，特别是儿茶素。18种OVA > 1的挥发性化合物是安化DTs的主要香气贡献者。内转录间隔区（ITS）和16S核糖体DNA测序显示，散囊菌属、假单胞菌属和芽孢杆菌属是安化DTs的优势微生物。此外，本研究还揭示了安化DTs与其他五种传统茶在化学成分上的显著差异。本研究增强了我们对安化DTs加工的认识。
亮点：
1. 对5种安化黑茶的化学成分进行了研究。
2. 使用基于代谢组学、挥发组学和电子感官的多组学分析。
3. 所有样品都来自相同的茶原料。
4. 对安化DTs的微生物群落进行了鉴定。
5. 研究了安化DTs与其他5种茶的化学成分差异。
论文ID
原名： Insight into the chemical compositions of Anhua dark teas derived from identical tea materials: A multi-omics, electronic sensory, and microbial sequencing analysis
译名： 深入了解来源于相同茶料的安化黑茶的化学成分：多组学、电子感官和微生物测序分析
期刊： Food Chemistry
IF： 8.8
发表时间： 2024.01
通讯作者： 朱洺志，王坤波，刘仲华
通讯作者单位： 湖南农业大学
实验设计
实验结果
1. UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS对非挥发性代谢物的非靶向代谢组学分析
1.1 非挥发性代谢物概况
本研究茶叶样品信息及实验方法如图1所示。在发酵微生物的影响下，安化DTs的代谢产物发生了各种变化，形成了安化DTs独特的化学特征。我们采用基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的非靶向代谢组学方法，分析了不同安化DTs的化学成分差异，并评估了安化DTs与其他5种茶的化学成分差异。根据负离子和正离子模式，我们在所有样品中共鉴定出11,604种代谢物，根据其化学性质分类，可分为13个超类(表S2)。这13个超类包括苯丙素和聚酮(1114种，例如黄烷类、黄酮类和单宁类)、生物碱和衍生物(54种)、有机酸和衍生物(936种)、有机杂环化合物(912种)、有机氧化合物(782种)、苯类(598种)、核苷、核苷酸和类似物(157种)、有机硫化合物(53种)、有机氮化合物(46种)、木脂素类、新木脂素及其相关化合物(39种)、碳氢化合物(13种)、脂质和类脂分子(3044种)和其他(3856种)。在PCA图中，安化DTs(红色椭圆)和其他五种茶(绿色椭圆)的样品可以明显区分，表明安化DTs与其他五种茶的代谢物存在显著差异(图2A)。此外，FBT-H-DT（茯砖茶）、FBT-M-DT（机制茯砖茶）、HBT-DT（黑砖茶）、QLT -DT（千两茶）和TJT-DT（天尖茶）的样品在HCA图中被很好地区分出来，这表明这些安化DTs的代谢物存在显著差异(图2B)。
图1 本研究茶叶样品资料及实验方法。(A)流程图描述了生产安化黑茶和其他五种茶的生产过程。整形*：机械整形; 整形**：手工整形。蓝色箭头和红色箭头分别表示机压茯砖茶和手筑茯砖茶的制作过程。(B)安化黑茶和其他五种茶叶的茶叶制品和茶汤图片。(C)本研究中使用的方法示意图。RT:室温;UHPLC-Q-Exactive Orbitrap- MS:超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用;GC-QqQ-MS:气相色谱-三重四极杆质谱;HPLC:高效液相色谱仪; GC × GC-TOF-MS:全二维气相色谱飞行时间质谱联用。
图2 安化黑茶和其他5种茶的代谢组学特征和主要化学成分的含量。(A-B) 超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法检测安化DTs和其他5种茶的代谢物的主成分分析(PCA)得分图(A)和层次聚类分析(HCA)图(B)。在PCA图中，红色椭圆代表安化DTs，绿色椭圆代表其他五种茶。(C)安化DTs和其他5种茶的代表性黄酮。(D)安化DTs和其他5种茶的水提取物、茶多酚和总游离氨基酸含量(%)。(E-H)儿茶素 (mg/g)、没食子酸(mg/g)、咖啡因和可可碱(mg/g)、茶氨酸(%)含量。(I) 13种氨基酸含量热图。同一化合物和柱状图前不同字母表示显著差异(单因素方差分析; P < 0.05)。
本研究调查了安化DTs与其他5种茶之间的关系(表S3)。TJT-DT是安化DTs中发酵程度最低、工艺最简单的DTs。我们统计了TJT-DT与其他安化DTs之间的差异代谢物（DAMs）。我们将TJT-DT与QLT-DT、FBT-M-DT、FBT-H-DT和HBT-DT进行比较，分别观测到331、323、287和294种DAMs。TJT-DT中大部分游离氨基酸(如茶氨酸和谷氨酸)含量高于其他安化DTs，二肽、三肽以及部分氨基酸衍生物含量低于其他安化DTs。这一结果与前人研究结果一致，即微生物发酵后的普洱茶中氨基酸及其衍生物含量下降，真菌还参与了蛋白质和寡肽类化合物的代谢。此外，与TJT-DT相比，QLT-DT中大多数脂质和类脂分子(如脂肪酰基、聚酮类化合物和甘油磷脂)、苯丙素类和聚酮类(如黄烷、类黄酮苷、异类黄酮)、有机酸及其衍生物的含量更高。与TJT-DT相比，FBT-M-DT和FBT-H-DT（手筑茯砖茶）中大多数类黄酮苷、聚酮、甘油磷脂、脂肪酰基和有机杂环化合物(如嘌呤和嘌呤衍生物)的含量较高，而大多数黄烷类化合物(如表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和一些茶黄素衍生物)的含量较低。大多数脂类和类脂分子(如脂肪酰基、甘油磷脂、萜苷类和倍半萜类)的含量较低，而某些类黄酮、类黄酮苷和黄烷类成分含量高于TJT-DT。这些结果表明，与TJT-DT相比，QLT-DT、FBT-M-DT、FBT-HDT和HBT-DT中的长期发酵或复杂处理方法导致某些化合物水平升高，特别是聚酮、生物类黄酮和聚类黄酮化合物，前期的文献也报道过类似的结果。
我们利用OPLS-DA将安化DTs与OT（乌龙茶）、YT（黄茶）、WT（白茶）、BT（红茶）和GT（绿茶）进行比较，分别鉴定出335、295、287、257和222种DAMs (VIP > 2, P < 0.01)。安化DTs中大部分有机酸及其衍生物、脂类及类脂分子(主要为脂肪酰基、聚酮类和甘油磷脂类)、苯丙类和聚酮类(主要为类黄酮苷类)含量上调，氨基酸、多肽、黄酮类、黄酮类和类黄酮苷类含量下调。这些结果表明，微生物在安化DTs中发酵导致蛋白质降解为小肽，氨基酸和黄酮类化合物转化，并形成类脂化合物。
1.2 全球天然产物分子网络系统(GNPS)分子网络分析
GNPS数据库能够根据谱库对质谱结果进行搜索，以识别已知的天然产物并发现其变体。通过GNPS分子网络分析，我们可以探讨光谱的相似性和差异。如图3A所示，以TJT-DT作为安化DTs的代表，我们在安化DTs和其他5种茶的分子网络中共发现了1914个节点。具有相似结构的光谱通过线连接形成代谢簇，如苯丙类和聚酮类，脂类和类脂分子(用实线圈标记)，为从已知光谱信息中发现新化合物提供了一种方法。例如，一些未知光谱(例如，m/z: 745.139, 751.104和783.115)被认为是茶黄素衍生物，因为这些未知光谱和茶黄素3-没食子酸酯在同一个代谢簇中。在TJT-DT、BT、WT、OT、GT和YT中分别鉴定出45、40、8、5、2和0个特有光谱(用虚线圈标记)。结果表明，与其他5种茶叶相比，安化DTs具有更多的特异性代谢物，这可能与微生物发酵有关。然而，这些光谱尚未被很好地识别。这些特异光谱的结构分析有助于在6种茶叶中，特别是在安化DTs中发现新的风味和保健相关的标记化合物。
如图3B所示，我们将5个安化DTs样本进行GNPS分析，探讨安化DTs之间的光谱相似性和差异性。在5个安化DTs的分子网络中共观察到2065个节点。多种化合物，如苯丙素和聚酮、脂类和类脂分子、有机酸和衍生物以及有机氧化合物，用线连接起来形成代谢簇(用实线圈标记)。值得注意的是，我们在TJT-DT、FBTH-DT、FBT-M -DT和QLT -DT中发现了少量的特有光谱(分别为11、4、8和6个)，而在HBT-DT中发现了大量的特有光谱(用虚线圈标记)。这表明HBT-DT与其他安化DTs在非挥发性代谢物方面存在显著差异，这解释了在PCA和HCA图中HBT-DT与其他安化DTs的显著分离。
图3 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS法检测安化DTs(A)以及安化DTs与其他5种茶(B)之间代谢物的分子网络。不同茶叶样品的特征代谢物用不同颜色的虚线椭圆聚类。TJT-DT:天尖茶;QLT-DT:千两茶;HPT-DT:黑砖茶;FBT-H-DT:手筑茯砖茶;FBT-M-DT:机制茯砖茶;BT:红茶;GT:绿茶;YT:黄茶;WT:白茶;OT:乌龙茶;PPPs:苯丙素和聚酮类化合物;LLLMs:脂质和类脂分子;OOCs:有机氧化合物;OADs:有机酸及其衍生物。
1.3 黄烷类成分的转化
黄烷类成分是茶叶中最丰富的多酚类物质，是茶中有益健康和口感的主要贡献者。安化DTs中黄酮类化合物的转化越来越受到关注。在本研究中，我们共鉴定出76种黄烷类成分，且每种茶都有特有的黄烷类成分(表S4)。其他5种茶和安化DTs中具有代表性的黄烷类成分如下(图2C): GT（绿茶）中含有高含量的单体儿茶素衍生物，如EGCG、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和没食子儿茶素(GC)；BT和OT中茶黄素及其衍生物，包括茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯和异茶黄素含量较高；WT中聚合儿茶素衍生物含量较高，如assamicain A和C, 4-β-(2-氨基乙硫基)，ECG和3,5-digalloylepicatechin；相比之下，安化DTs中大多数黄烷类成分含量较低，这可能与微生物作用下的复杂转化有关。
我们对安化DTs中类黄酮化合物的微生物转化产物进行了研究。近年来，研究者在安化DTs中发现了多种转化产物，如黄烷-3-醇B环裂变类似物和8-C N-乙基-2-吡咯烷酮取代黄烷-3-醇(EPSFs)。这些黄烷- 3-醇B环裂变类似物包括fuzhuanins A (ID 1640)和D (ID 1467)(表S4)。除QLT -DT外，安化DTs中fuzhuanins A的含量高于其他5种茶；安化DTs中fuzhuanins D的含量高于其他5种茶。安化DTs中fuzhuanins A和D的含量高，主要是由微生物转化所致。FBT-M-DT和FBT-H-DT中的fuzhuanins A含量高于HBT-DT、QLT-DT和TJT-DT；FBT-M-DT中fuzhuanins D的含量也高于其他安化DTs。因此，FBT-DT的长时间「发花」过程促进了fuzhuanins A和D的形成。EPSFs包括EGC-cThea (ID 1494)和EC-cThea (ID 1268)。前期研究发现，EPSFs是由黄烷-3-醇和茶氨酸聚合形成的。近年来，人们发现EPSFs与储存时间密切相关，并将其作为预测白茶、普洱茶和绿茶储存时间的标记化合物。值得注意的是，除HBT-DT外，安化DTs中EGC-cThea含量显著高于其他5种茶；安化DTs中EC-cThea的含量明显高于其他5种茶。这些结果表明，发酵微生物可能促进了EPSFs的合成。因此，EGC-cThea和EC-cThea可以作为安化DTs的标记化合物。
2. 非挥发性代谢物的靶向代谢组学分析
本研究针对水提取物、茶多酚、儿茶素、没食子酸(GA)、生物碱(咖啡因和可可碱)、茶氨酸等13种游离氨基酸进行检测(图2D-I，表S5)。QLT -DT、HBT-DT、FBT-H-DT、FBT-M-DT的水提物含量差异不大，但显著低于TJT-DT；除TJT-DT外，安化DTs的水提物含量高于BT，低于GT、YT、WT和OT。QLT-DT、HBT-DT、FBT-H-DT和FBT-M -DT中的茶多酚含量也低于TJT-DT；除FBT-H-DT外，安化DTs多酚含量均高于BT，低于GT、YT、WT和OT。与水提物和茶多酚含量相似，TJT-DT中总儿茶素含量高于其他安化DTs提取物，也高于BT，但低于GT、YT、WT和OT。此外，安化DTs提取物中的总儿茶素含量比GT降低了约50 - 60%。水浸出物含量是茶汤浓郁度的重要指标。以儿茶素为主要成分的多酚是茶叶中主要的次生代谢产物，占茶叶干重的8 - 26%。安化DTs和BT的水提取物、茶多酚和总儿茶素含量低，可分别归因于微生物转化和酶转化；对于安化DTs中TJT-DT的水浸提物、茶多酚和总儿茶素含量较高，可归因于发酵程度低和加工方法简单。
儿茶素被认为是对健康有益和茶的苦味和涩味的重要贡献者。安化DTs的EGCG和ECG含量高于BT，但分别为GT、YT、WT和OT的0.78 - 51.73%和6.04 - 68.48%。然而，与EGCG和ECG含量相比，安化DTs与4种茶(GT、YT、WT、OT)的EGC含量差异较小。安化DTs中GA含量显著高于其他5种茶。同时，FBT-H-DT和FBT-M-DT中EGCG含量极低于其他安化DTs，而FBT-H-DT和FBT-M-DT中GA含量显著高于其他安化DTs。以上结果表明，没食子儿茶素(如EGCG和ECG)被水解为非没食子儿茶素(如EGC和EC)。在发酵微生物的作用下，安化DTs中的EGCG和EGC含量较低，而BT中的EGCG和EGC含量较低是由于酶的氧化作用引起的。此外，与其他安化DTs相比，FBT-H-DT和FBT-M-DT中独特的「发花」过程使没食子酸儿茶素的水解更强。
咖啡因是茶中主要的生物碱，是茶的苦味和对健康有益的主要贡献者。与儿茶素不同，所有茶中咖啡因的含量相对稳定。尽管如此，安化DTs中咖啡因的含量仍略低于GT、WT和OT。这表明安化DTs和BT是咖啡因敏感人群的良好选择。游离氨基酸通常被用作优质茶叶品质的指标。茶氨酸约占游离氨基酸的50%，对茶的鲜味至关重要。安化DTs中的茶氨酸含量和游离氨基酸总含量低于GT、YT、WT和OT。对于安化DTs，TJT-DT中的茶氨酸和总游离氨基酸含量高于其他安化DTs。因此，微生物发酵导致了安化DTs中茶氨酸和总游离氨基酸的显著减少；对于安化DTs, TJT-DT中茶氨酸和总游离氨基酸含量较高归因于发酵程度低，加工方法简单，与水提物、茶多酚和总儿茶素含量变化相似。前期研究已经证明，氨基酸可以通过发酵微生物转化为挥发性化合物和儿茶素氨基酸聚合物。氨基酸的转化对安化DTs的风味和保健作用有重要影响。
3. 利用GC × GC-TOF-MS对挥发性代谢物进行非靶向挥发组学分析
本研究采用HS-SPME-GC × GC-TOF-MS测定挥发性代谢物。我们共鉴定出638种挥发性化合物(表S6)。PCA图显示，安化DTs、GT、YT样本与BT、OT、WT样本分离明显，但安化DTs与GT、YT样本分离不明显(图4A)。此外，HCA图与PCA图显示出相同的结果。前期研究表明，BT和WT中挥发性代谢物的浓度与其他茶种相差较大，这与我们的研究结果相似(图4B)。安化DTs、GT和YT经过了固定处理，而BT、OT和WT在加工或发酵前不需要杀青，杀青过程对6种茶的挥发性代谢物有显著影响。本研究考察了安化DTs与其他5种茶之间的差异积累的挥发性化合物（DAVOCs）(图4C, 表 S7/Sheet1)，基于OPLS-DA模型发现DAVOCs 77种(VIP > 1, P < 0.05)，这77种DAVOCs可作为区分安化DTs与其他5种茶的特征化合物：其中，6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮、乙酸丁酯、乙酸、苯酚、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3-丁二酮、2,3-辛二酮和四甲基吡嗪等15种DAVOCs的含量在安化DTs中显著高于其他5种茶。这15种DAVOCs散发着果香、刺激性气味、花香、茉莉香，构成了安化DTs的独特香气。然而，安化DTs中其他62种DAVOCs的含量低于WT、OT和BT，这62种挥发性代谢物占DAVOCs的大部分。因此，与WT、OT和BT相比，安化DTs整体上具有较低的挥发性代谢物浓度，这与之前的研究相似。
本研究还筛选了5种安化DTs之间的DAVOCs(图4D，表S7/Sheet2)。如图4D所示，TJT-DT与其他4种安化DTs在挥发性代谢物方面存在较大差异。共有62种DAVOCs可作为区分TJT-DT与其他安化DTs的特征化合物。大多数DAVOCs(62种中有50种)在TJT-DT中的含量高于其他安化DTs，这表明，与TJT-DT相比，QLT -DT、HBT-DT、FBT-H-DT和FBT-M-DT经过长时间发酵或复杂的加工方法导致了大多数DAVOCs的降解。相比之下，QLT -DT、HBT-DT、FBT-H-DT和FBT-M-DT中11种DAVOCs的含量高于TJT-DT。这11种DAVOCs包括(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-氧化芳樟醇(呋喃类)、(E,E)-2,4-癸二烯醛、甲苯、藏花醛、2-甲基-1-戊烯-3-酮、(S-(R*，R*))-2,3-丁二醇、二氢猕猴桃内酯、1-辛烯-3-醇、丙酮和(S)-(-)-柠檬烯。结果表明，长时间发酵或复杂的加工方法也导致了这些挥发性化合物在QLT -DT、HBT-DT、FBT-H-DT和FBT-M-DT中的形成，使这些安化DTs具有脂肪气、木香、花香、水果、麝香、蘑菇香、泥味和甜味。
4. GC-QqQ-MS对挥发性代谢物的靶向代谢组学分析
本研究采用HS-SPME-GC-QqQ-MS对挥发性代谢物进行了针对性测定。我们在安化DTs共检测到51种挥发性化合物，其中酮类15种，醛类13种，醇类10种，酯类5种，methoxybenzenes 3种，芳烃类3种，酚类2种(表S8)。PCA图显示，安化DTs、GT和YT可以从BT、OT和WT中分离出来，但安化DTs不能从GT和YT中分离出来，这与GC × GC- TOF -MS的结果一致(图4E)。此外，BT的总挥发性代谢物含量最高，其次是WT、OT、安化DTs (平均)、YT和GT，这与之前的报道相吻合。与WT、OT和BT相比，安化DTs、YT和GT的挥发性代谢物整体含量较低，说明酶转化在挥发性代谢物合成中的效率更高。此外，与GC × GC- TOF -MS的结果相似，靶向分析也证明了安化DTs、GT、YT的挥发性成分具有一定的相似性。这表明安化DTs、GT和YT共有的固定过程对茶叶挥发性代谢物有重要影响。
我们比较了安化DTs不同品种之间的挥发性代谢物含量。PCA结果表明，5个安化DTs之间存在明显的分离(图4E)，突出了发酵过程和发酵微生物的重要性。靶代谢组学分析表明，FBT-M-DT、FBT-H-DT、HBT-DT和QLT -DT的总挥发性代谢物含量高于TJT-DT。然而，我们的非靶向代谢组学结果显示，TJT-DT中大多数DAVOCs的相对含量高于其他安化DTs，这意味着非靶向和靶向代谢组学结果可能是矛盾的。这是因为受到检测能力的限制，这些挥发性代谢物无法通过靶向代谢组学检测并进行绝对定量。这些挥发性代谢物大多是低沸点物质，在后续加工过程中挥发，从而导致FBT-MDT、FBT-H-DT、HBT-DT和QLT -DT的相对丰度明显低于TJT-DT。此外，根据代谢组学分析，TJT-DT中一些挥发性化合物的含量低于其他安化DTs。这些挥发性化合物包括二氢猕猴桃内酯、水杨酸甲酯、棕榈酸甲酯、1,2,3-三甲氧基苯、植物蛋白胨、(E,E)-2,4-庚二烯醛、己醛和氧化芳樟醇2。与其他安化DTs相比，二氢猕猴桃内酯是造成TJT-DT中总挥发性代谢物含量较低的主要原因。FBT-M-DT和FBT-H-DT中挥发性成分的显著增加可能与微生物参与「发花」步骤有关。
挥发性化合物对茶叶香气的最终贡献取决于其气味活性值(OAV)。我们在安化DTs和其他5种茶中共检测到22种OAV > 1的挥发性化合物(表S9)，其中14种化合物的OAV在所有样品中均大于1。前人的研究认为这14种化合物是茶叶中重要的香气成分。其中，α-甲基萘(药香，OAV = 51.16)和雪松醇(木香，OAV = 16.13)在QLT -DT中的OAV最高；在HBT-DT中，藏花醛(OAV = 3.8，药香和木香)的OAV最高；1,2,3-三甲氧基苯(OAV = 72.03，药香、木香和陈香)和1,2,4-三甲氧基苯(OAV = 7.01，木香和陈香)在FBT-H-DT中的OAV最高。此外，α-紫罗兰酮(OAV = 25.24，花香和甜香)、β-紫罗兰酮(OAV = 551.11，花香和果香)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(OAV = 53.57，果香和甜香)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(OAV = 40.29，花香、果香和脂肪气)、柠檬醛2 (OAV = 9.43，果香)、己醛(OAV = 67.23，果香和生青味)和苯乙醇(OAV = 27.4，果香和甜香)在BT中的OAV最高；β-环柠檬醛(OAV = 2.8，花香和果香)在OT中的OAV最高;在WT中，芳樟醇(OAV = 20.86，花香和果香)的OAV最高。因此，这些化合物的OAVs决定了不同类型茶叶的香气。
值得注意的是，8种OAVs > 1的化合物仅在某些类型的茶叶中出现。二氢猕猴桃内酯的OAV > 1 (OAV = 1.03)，仅在FBT-M-DT中存在，使FBT-M-DT具有麝香和果香。庚醛在HBT-DT (OAV = 1.02)、FBT-H-DT (OAV = 1.65)和BT (OAV = 1.11)中OAV > 1，表现出强烈的令人不愉快的脂肪气味。除BT、QLT -DT和FBT-M-DT外，1-辛-3-醇在所有样品中的OAV均> 1 (OAV = 1.27 ~ 5.24)，并产生生青味、蘑菇香和泥味。除GT、YT和WT外，(E, E)-2,4-庚二烯醛在所有茶叶样品中的OAV > 1 (OAV = 1.32-2.82，脂肪气味)。2-戊基呋喃在GT (OAV = 1.38)、WT (OAV = 2.4)、OT (OAV = 4.88)和BT (OAV = 2.07)中的OAV > 1，并表现出果香、生青味和坚果香。(E)-2-己烯醛在WT (OAV = 3.74)和BT (OAV = 15.26)中的OAV均> 1，使得WT和BT具有生青味、果香、辛辣和类似蔬菜味。(E)-橙花叔醇在OT (OAV = 4.02)和BT (OAV = 2.0)中的OAV均> 1，使得OT和BT具有花香、果香和甜香。苯乙醛仅在BT中OAV > 1 (OAV = 2.36，蜜香，类似玫瑰香和甜香)。这些OAV结果表明，安化DTs具有多种药香、木香、脂肪气、麝香和陈香，而其他5种茶具有更浓郁的花香、甜香和果香。
5. 气相色谱-质谱法分析脂肪酸代谢组学
脂肪酸(主要是中链和长链脂肪酸)是茶叶重要的香气前体物质，可降解为C6-C9挥发性醇、醛、酮和酯，并具有甜香或花香。因此，脂肪酸(如亚麻酸、亚油酸、棕榈酸和油酸)的降解与茶叶的香气品质密切相关。本研究采用气相色谱-质谱法对22种脂肪酸进行绝对定量测定(表S10)。高度发酵后的FBT-M-DT和FBT-H-DT中总脂肪酸含量显著低于普通发酵的QLT -DT、TJT-DT和HBT-DT(图4F)。这表明FBT-DT在「发花」过程中大量消耗脂肪酸，这与Zhu等人的观点一致。因此，微生物发酵有助于DT中独特香气的形成。此外，高度发酵后的FBT-M-DT和FBT-H-DT的总脂肪酸含量也明显低于GT和YT，但与BT、WT和OT的差异较小(图4F)。这表明，与微生物发酵过程类似，BT、WT和OT的酶解过程对脂肪酸的降解有显著影响，而GT和YT的处理对脂肪酸的降解影响相对较小。此外，本研究还分析了13种脂肪酸衍生挥发物与脂肪酸的相关性(表S11)。结果表明，这些脂肪酸衍生挥发物的含量与脂肪酸含量呈极显著负相关(Spearman系数= -0.64,n = 30, P < 0.01)。Chen 等人发现脂肪酸的降解在BT的脂肪酸衍生挥发物的生成中起着至关重要的作用，我们的研究结果证明，这一结论同样适用于所有6种茶叶，说明了脂肪酸降解对茶叶香气的影响。
图4 安化DTs与其他5种茶的挥发性成分及香气特征比较。(A-B) GC × GC-TOF-MS检测的安化DTs和其他5种茶叶挥发性成分的PCA得分图(A)和层次聚类分析(HCA)图(B)。在PCA图中，红色椭圆表示安化DTs。(C) 安化DTs与其他5种茶的差异累积挥发性成分相对含量热图；(D) 安化DTs之间的差异累积挥发性成分相对含量热图；(E)GC法检测安化DTs和其他5种茶的PCA得分图。红色椭圆代表安化DTs，绿色椭圆代表其他5种茶。(F)中、长链脂肪酸总含量(μg/g)。
6. 安化DTs微生物群落研究
发酵微生物在安化DTs品质的形成中起着不可或缺的作用，它们参与了各种化学成分的分解、合成和转化。此外，发酵后的安化DTs中仍存在部分发酵微生物，这对安化DTs的食用安全性有重大影响。因此，我们通过高通量ITS和16S rDNA扩增子测序，分析了安化DTs的真菌和细菌群落。我们在5个安化DTs中共鉴定出真菌群落5门12纲25目37科46属，细菌群落27门57纲120目197科291属。本研究在TJT-DT、QLT-DT、HBT-DT、FBT-M-DT和FBT-H-DT中分别注释了18、26、11、21和39个真菌属和76、144、61、118和114个细菌属。这些结果表明了安化DTs中存在较高的微生物多样性。此外，散囊菌属、 Blastobotrys 、枝孢属、附球菌属、节担菌属、 Saitozyma 、念珠菌属、古根菌属、链格孢属和红菇属是5个安化DTs中排名前10位的真菌属(图5A，表S12)。值得注意的是，散囊菌属是绝对优势真菌属，占5个安化DTs的93.04 - 99.30%。已有研究证明，FBT-DT中的散囊菌属主要鉴定为冠突散囊菌。因此，本研究推测FBT-M-DT和FBT-H-DT中的散囊菌属主要为冠突散囊菌。
排名前10的细菌属分别是假单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、考克氏菌属、不动杆菌属、小球菌属、李斯特菌属、短杆菌属、埃希菌属和拟杆菌属(图5B，表S12)。这些细菌在之前的DTs研究中已经发现，但它们的丰度在不同的研究中差异很大。假单胞菌属和芽孢杆菌属为优势菌，占本研究全部序列的5.56 ~ 36.99%。假单胞菌属、芽孢杆菌属在自然环境中无处不在。一些假单胞菌属具有抗炎作用，通过降解有害物质(如农药残留和芳香化合物)来进行解毒作用，还可以通过代谢乳酸和竞争性抑制肠道有害细菌的生长来调节肠道。芽孢杆菌属是肠道中重要的有益菌，常被用作益生菌。因此，假单胞菌属和芽孢杆菌属不仅对安化DTs的感官品质有显著影响，而且可能在安化DTs的潜在健康益处中发挥至关重要的作用。此外，HBT-DT中细菌的相对丰度与其他安化DTs有显著差异。HBT-DT中的拟杆菌属相对含量高于其他安化DTs。这些结果表明细菌可能是导致HBT-DT与其他安化DTs之间代谢物差异较大的因素之一。
为了探索安化DTs中发酵微生物与代谢物之间的潜在相关性，我们通过Pearson相关分析构建了安化DTs中排名前10位的微生物(细菌和真菌)与DAMs的关联网络(图5C)。排名前10的真菌属在安化DTs代谢产物转化中发挥了重要作用，这与前期研究相似。值得注意的是，在各种安化DTs中，细菌与DAMs之间存在很强的相关性，特别是与脂类和类脂分子以及苯丙素和聚酮类成分。这一发现表明，细菌也对不同安化DTs代谢产物的改变有显著影响。
7. 电子感官特性及其与化学成分的关系
电子传感器技术是感官评估的重要方法，与人类相比，它提供了更敏感、数字化和客观的感官特征描述。我们采用电子眼、电子舌、电子鼻联合应用，综合评价安化DTs的香气、茶汤口感、茶汤颜色。此外，本研究还分析了电子感官特性与化学成分之间的相关性。
7.1 电子鼻分析
雷达图显示了电子鼻响应值。在安化DTs中，传感器P40/1、T70/ 2和P30/1的响应值变化较小，而在FBT-M-DT和FBT-H-DT中，传感器LY2/G、LY2g/CT和PA/2的响应值明显低于其他安化DTs (图5D)。此外，我们选择TJT-DT作为安化DTs的代表，与其他5种茶进行电子鼻响应值的差异比较(图5E)。传感器PA/2、LY2/ gCT和LY2/G在TJT-DT和GT中的响应值显著高于其他茶种。传感器PA/2、LY2/gCT和LY2/G对乙醇、氨水、胺、丙烷、丁烷、碳和含氧化合物敏感，表明TJT-DT和GT之间这些化合物的组成和含量可能相似。T70/2和P30/1传感器对OT、WT和YT的香气化合物更为敏感，可捕获甲苯、二甲苯、一氧化碳、碳氢化合物、氨和乙醇相关化合物。PCA图进一步说明了电子鼻传感器与各种茶叶样品之间的相关性(图5F)。电子鼻传感器与挥发性化合物之间的关系在图5G-H上进一步阐明。结果表明，T70/2、LY2/G和LY2/gCT传感器对安化DTs中挥发性化合物更为敏感(图5G)。此外，PA/2、LY2/ gCT和T70/2传感器对TJT-DT和其他5种茶之间挥发性化合物的反应更为敏感(图5H)。
图5 安化DTs微生物群落及电子鼻传感器与GC-QqQ-MS检测DAVOCs的相关性(A-B)安化DTs中排名前10真菌属(A)和细菌属(B)的相对丰度。(C) 通过 Pearson 相关分析，分析安化 DTs 中差异积累代谢物与真菌和细菌之间的关系（|系数| ≥ 0.85 且 P < 0.05）。红线表示正相关，蓝线表示负相关。(D-E)安化DTs(D)以及安化DTs与其他5种茶(E)之间的电子鼻传感器响应得分。(F)电子鼻传感器与不同茶叶样品的PCA双标图。(G)安化DTs之间电子鼻传感器与DAVOCs的相关性分析；(H)安化DTs与其他5种茶的电子鼻传感器与DAVOCs的相关性分析。
7.2 电子舌分析
雷达图显示了电子舌的特征，包括酸味、苦味、苦的回味、涩味、涩的回味、鲜味、浓郁度、咸味和甜味(图6A，表S13)。安化DTs的苦味强度较高，FBT-M-DT和FBT-H-DT的苦味强度最高，而除BT外，其他种类的茶的苦味强度都低于安化DTs，所有样品的苦的回味值趋势与苦味相似。GT中的涩味和涩的回味强度高于其他茶叶样品，这可能是由于GT中多酚和儿茶素含量较高引起的。与其他8种茶相比，BT和FBT-M-DT的鲜味强度较低，而其他8种茶的差异很小。BT 中的浓郁度最低，这与 BT 中水提取物的含量最低一致。与其他茶样品相比，GT、YT、WT 和 OT 的咸味强度较高。安化DTs和BT的甜度值高于GT、YT、WT和OT。此外，这些结果也直观地显示在 PCA 双标图中（图 6B）。
大量的味觉化合物相互作用，构建了茶汤迷人而复杂的味觉特征。通过TJT-DT与其他安化DTs、TJT-DT与其他5种茶的比较，我们从OPLS-DA模型中分别筛选出差异性非挥发性代谢物288和346种(VIP > 2, P < 0.01)，它们可作为特征性代谢物(表S14)，随后通过PLSR模型分析这些差异的非挥发性代谢物与电子舌味觉特征的相关性(图6C-D)。每个数字代表一种代谢物，代谢物的序号与名称的对应关系见表S14。如图6C所示，安化DTs的代谢物大部分位于x轴右侧，与苦味、苦的回味、甜度、浓郁度、酸味呈正相关，这些代谢物包括大部分木脂素、新木脂素及其相关化合物和有机杂环化合物。此外，安化DTs的鲜味、咸味、涩味和涩的回味的味觉特征彼此靠近。这些味觉特征与部分木脂素、新木脂素及其相关化合物、有机杂环化合物、有机酸及其衍生物(如茶氨酸，No.34；2-氨基庚二酸，No.1683；甘氨酸No.580；和谷氨酸，No.133)和大多数核苷、核苷酸和类似物、有机氧化合物、苯丙素和聚酮类化合物(例如EGCG，No.414；芹糖异甘草苷, No.1112；EGC-(4β→8)-C, No.193；isoneotheaflavin-3-O-gallate, No.623；EC-(4β→8)- EGC -3-O-gallate, No. 344；原翠雀素 B, No. 1660)正相关。因此，PLSR模型清楚地说明了安化DTs中特征代谢物的味道特征。TJT-DT与其他5种茶的差异非挥发性代谢物和口感特征的相关性显示在图6D中。这些结果有助于揭示代谢物对茶汤口感特征的综合影响。
图6 安化DTs与其他5种茶的口感特征与代谢物的关系。(A)电子舌探测到的味觉特征雷达图。(B)味道特征与不同茶样的PCA双标图。(C-D) PLSR分析安化DTs之间(C)以及安化DTs与其他5种茶之间(D)的口感特征与差异积累代谢物的相关性。Aftertaste-A:涩的回味;Aftertaste-B: 苦的回味。
7.3 电子眼分析
我们采用L*、a*、b*色标对电子眼色差进行量化(表S15)。L*表示明或暗，a*表示红或绿，b*表示黄或蓝。随着发酵程度的增强，L*和b*值有减小的趋势，a*值有增大的趋势(L*和b*值的变化趋势:GT、YT和WT > OT >安化DTs > BT；a*的变化趋势: GT、YT、WT < OT <安化DTs< BT)。此外，不同DTs之间的L*、a*、b*值也略有差异。只有FBT-H-DT的a*值显著高于其他DTs，说明FBT-H-DT的茶汤颜色是DTs中最红的。GT、YT和WT的L*、a*和b*值差异较小。我们通过相关分析研究了茶汤颜色与口感特征之间的关系。结果显示，茶汤颜色与茶的口感特征存在相关性(表S16)，说明利用电子眼可以初步判断茶汤的口感特征。
结论
综上所述，本研究采用基于靶向代谢组学和非靶向代谢组学的多组学方法，结合电子感官评估，系统地揭示和比较了5种安化DTs的植物化学特征和感官特征。长期发酵或复杂的加工方法导致大多数化合物的含量减少，包括儿茶素和氨基酸。非挥发性物质的变化影响了安化DTs的口感特征。18种OAV > 1的挥发性化合物是安化DTs的香气主要贡献者，产生脂肪气、木香、泥味和甜香。相关分析揭示了挥发性化合物与电子鼻传感器、非挥发性代谢物与味觉特征、茶汤颜色与味觉特征之间的关系。微生物测序结果显示，安化 DTs 中的真菌主要是散囊菌属，细菌主要是假单胞菌属和芽孢杆菌属。此外，本研究揭示了安化DTs与其他5种茶在非挥发性化合物方面的显著差异。本研究结果为安化DTs的加工和质量控制提供了理论依据。未来的研究将利用代谢组学、宏基因组学和蛋白质组学，更深入地了解不同加工阶段的代谢物、基因、微生物群落和蛋白质的变化。
