蝴蝶蘭黑頭病的病原診斷和防治方法
周勤等
蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬植物， 原產地為熱帶、副熱帶地區， 素有 「洋蘭皇後」 的美譽 。 ２０ 世紀 ９０ 年代末， 蝴蝶蘭作為一款高檔花卉從中國台灣引入大陸， 其葉片寬厚碧綠、 花色多彩俏麗、 花型優美大氣， 符合國人喜慶、 熱鬧、 團圓等傳統氣氛， 結合其花期長等優點， 成為年宵花和禮品花的首選 ， 廣受消費者的喜愛。 近年來， 隨著蝴蝶蘭趨向於平價化， 浙江省蝴蝶蘭年交易量基本穩定在 ５００ 萬株左右， 銷售額達上億元， 並有不斷發展的趨勢。 但蝴蝶蘭在栽培過程中容易發生一種病害， 肉質葉的基部發黑變褐導致莖基部腐爛， 花農稱該病為黑頭病。 目前， 不同蝴蝶蘭品種黑頭病的發生差異較大， 易感品種的病株率為 ５％ ～ ５０％，催花抽梗後發病尤為嚴重。 由於該病發病初期不易被發現， 一旦發現難以防控， 且發病速度迅猛， 花農損失較大， 成為遏制蝴蝶蘭產業發展的瓶頸之一。為了促進蝴蝶蘭產業的快速健康發展， ２０２１年浙江省啟動了農業重大技術協同推廣計劃專案，專案組調查了杭州蘭派農業科技有限公司、 杭州百盛精準農業有限公司和浙江啟美生態農業有限公司等杭州市主要蝴蝶蘭生產企業的黑頭病發生情況和品種抗性等， 鑒定了引起黑頭病的主要病原， 並提出預防蝴蝶蘭黑頭病發生的關鍵節點和技術方法，為蝴蝶蘭產業的高質素發展提供切實有效的技術支持。
１ 材料與方法
１. １ 病樣的采集
２０２１ 年 １１ 月， 在杭州蘭派農業科技有限公司、 杭州百盛精準農業有限公司和浙江啟美生態農業有限公司等蝴蝶蘭種植基地分別采集數十個蝴蝶蘭黑頭病樣品， 對莖基部的典型病斑用蔡氏光學顯微鏡 ＡＸ１０ 鏡檢， 並保存備用。
１. ２ 病原的分離純化
采集黑頭病的典型病樣， 並用組織分離方法進行分離純化。 病健組織切成 ５ ｍｍ×５ ｍｍ 的小塊，並用 ７０％乙醇消毒 ４０ ｓ， 用無菌水沖洗 ３ 次， 再用無菌濾紙吸幹水分後， 置於馬鈴薯葡萄糖瓊脂（ＰＤＡ） 培養基上， 於 ２５ ℃ 黴菌培養箱黑暗培養５ ｄ。 將獲得的不同菌落的菌絲塊置於新的 ＰＤＡ 培養基進行單獨培養。 培養至產孢後， 單孢純化獲得不同菌株， 並保存備用。
１. ３ 致病性測定
將獲得的不同分離菌株在 ＰＤＡ 培養基上培養５ ｄ 後， 用 ５ ｍｍ 打孔器從菌落邊緣打出菌碟， 避開葉片主脈放置在健康的蝴蝶蘭品種 ＬＬ２９ 葉片上（４～５ 片葉）。 以 ＰＤＡ 培養基空白塊為對照， 保濕４８ ｈ， 於 ２５ ℃光照培養箱 （１２ ｈ 光照／１２ ｈ 黑暗）培養， 每天觀察病斑的形成和癥狀特征。
１. ４ 分子鑒定系統性分析
采用 Ｅｚｕｐ 柱式真菌基因組 ＤＮＡ 抽提試劑盒提取分離物的基因組 ＤＮＡ， 核糖體內部轉錄間隔區（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ， ＩＴＳ） 擴增通用引物ＩＴＳ１／ ＩＴＳ４ 、 甘油⁃３⁃磷酸去氫酶 （ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ⁃３⁃ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ＧＡＰＤＨ） 基因內含子引物 ＧＤＦ１／ ＧＤＲ１ 、 肌動蛋白 （Ａｃｔｉｎ， ＡＣＴ） 引物 ＡＣＴ⁃５１２Ｆ／ ＡＣＴ⁃７８３Ｒ 、 延遲因子 （ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １⁃ａｌｐｈａ， ＴＥＦ） 引 物 ＥＦ１⁃７２８Ｆ／ＥＦ１⁃９８６Ｒ 和 β 微管蛋白 （β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ， ｔｕｂ２） 引物ＢＴ⁃２ａ／ ＢＴ⁃２ｂ 由北京擎科生物有限公司合成。 炭疽菌以 ＩＴＳ＋Ａｃｔ＋ＧＡＰＤＨ＋Ｔｕｂ 的順序， 鐮刀菌以ＩＴＳ＋ＴＥＦ 的順序進行排列， 將獲得的各基因串聯成數據集， 采用最大似然法 （ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，ＭＬ）， 利用軟件 Ｍｅｇａ ７. ０ 將分離到的菌株分別與已發表的 １０ 個炭疽病菌菌株和 １８ 個鐮刀菌菌株構建系統發育樹， 設定 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 為 １ ０００。
１. ５ 黑頭病的品種抗性調查
調查了杭州蘭派農業科技有限公司、 杭州百盛精準農業有限公司和浙江啟美生態農業有限公司等蝴蝶蘭種植基地中的 ２１ 個蝴蝶蘭品種的黑頭病發生率， 篩選出抗性品種。
２ 結果與分析
２. １ 病原診斷和癥狀描述
觀察蝴蝶蘭苗期、 抽梗期和開花期的黑頭病病癥， 並對這些病斑進行植物病理學的鏡檢、 組織分離、 病原純化鑒定以及致病性測定後， 結果發現黑頭病可以細分為 ２ 類病癥， 由不同的病原真菌侵染引起， 分別為炭疽類 （Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ． ）和鐮刀類 （Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ）， 即蝴蝶蘭黑頭病是由炭疽類真菌引起的炭疽病和鐮刀菌類真菌引起的枯萎病２ 種病害組成。
炭疽病病斑常在莖基部出現， 最初為褪綠或褐色小點， 後變為圓形或不規則形黑色病斑， 病斑後期變為灰白色， 有時有輪紋， 病部密生小黑點， 濕度高時小黑點可分泌出猩紅色黏孢子團， 或產生規則排列的白色絨毛狀小點。 病斑擴充套件至整個葉柄主脈時葉片發黃或枯死， 枯死的老葉正反兩面均可見密生小黑點。 該病也在葉面上發生， 可形成略凹陷的針點狀小斑點 （圖 １）。
圖 １ 由虎頭蘭刺盤孢侵染引起的蝴蝶蘭黑頭病的田間典型癥狀
枯萎病初發時病部為水漬狀褪綠病斑， 後發展成半圓形或不規則形， 病斑黑色， 略凹陷， 病部葉片常發紅或發黃。 濕度高時， 病部可出現白色黴層， 發病莖部脆弱， 易折斷。 最後病斑擴充套件整個葉基部， 葉片斷裂、 脫落， 病斑繼續向上向下蔓延，直至整株枯死。 該癥狀蝴蝶蘭苗期、 催花和開花等階段均可發病 （圖 ２）。
圖 ２ 由茄病鐮孢侵染引起的蝴蝶蘭黑頭病的田間典型癥狀
２. ２ 病原鑒定
根據蝴蝶蘭苗期、 抽梗期和開花期發生的黑頭病病癥， 我們發現黑頭病由炭疽類和鐮刀菌類 ２ 種病原真菌侵染形成。 這 ２ 種病害癥狀和發生條件都非常相似， 較難分辨。 采用組織分離法從這 ２ 種蝴蝶蘭病樣中分離獲得數十個不同的分離物菌株。 將這些分離物置於新鮮 ＰＤＡ 培養基上於 ２５ ℃ 黑暗培養。
炭疽類病原菌呈放射狀生長， 初生菌絲白色，短絨毛狀， 後變深橄欖色至黑灰色。 該菌在 ＰＤＡ固體培養基上不易產孢， 在液體 ＰＤＡ 中 ２５ ℃培養５ ｄ 可產生少量分生孢子。 分生孢子透明， 桿形，１４. ３～１９. ８ μｍ×５. ０～５. ４ μｍ。 在寄主植物上可產生大量近球形黑色孢子器， 嵌於葉組織內， 具一個孔口， 有的有剛毛。 有性形態子囊孢子， 桿狀， 單孢， 透明， １ ～ ２ 個油球， 或油球不明顯。 從菌落形態上初步判斷為虎頭蘭刺盤孢 。
鐮刀菌類在培養基上呈放射狀生長， 白色絨毛狀， 菌落背面為土黃色； 產生大量的卵形小型分生孢子， ８. ０～１６. ０ μｍ×２. ５～４. ０ μｍ， 以及少量馬特型大型分生孢子， 兩端較鈍， 基部細胞有足跟，３～５ 隔， ２３. １～５８. ４ μｍ×３. ０～６. ０ μｍ。 根據菌落形態初步判斷為茄病鐮孢 。
２. ３ 致病性測定
將 ２ 種病原分離物培養 ５ ｄ 後接種至健康的蝴蝶蘭植株上， 接種 ４ ｄ 後 ２ 種分離物的接種處均產生病斑。 炭疽類分離物接種後產生的病斑為深褐色，病健交界清晰， 有少許黃暈， 病斑略凹陷， 有時有輪紋。 茄病鐮刀菌分離物接種後最初產生水浸狀淡褐色病斑， 後期病斑顏色略變深， 隨著病斑的擴充套件，病健交界模糊， 周圍葉肉或整個葉片明顯變黃或變紅。 這 ２ 種病原分離物對蝴蝶蘭均有較強的致病性。而對照植株無病斑。 根據柯赫氏法則， 從接種部位重新分離出了對應的相同病原物， 因此， 確認這 ２種病原分別為蝴蝶蘭黑頭病的 ２ 種病原菌 （圖 ３）。
圖 ３ 由虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢侵染引起的蝴蝶蘭黑頭病的接種癥狀
Ａ—虎頭蘭刺盤孢接種後 ７ ｄ； Ｂ—茄病鐮孢接種後 ７ ｄ； Ｃ—空白對照。
２. ４ 蝴蝶蘭黑頭病的分子鑒定
使用 Ｍｅｇａ ７. ０ 軟件， 采用鄰接法拼接序列，
將典型病原菌菌株的 ＩＴＳ ｒＤＮＡ 基因、 肌動蛋白基
因 （ＡＣＴ）、 微管蛋白基因 （Ｔｕｂ） 和甘油磷酸脫
氫酶基因 （ＧＡＰＤＨ） 序列和轉譯延長因子 （ＴＥＦ）
與 ＧｅｎＢａｎｋ 中的 Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ 屬和 Ｆｕｓａｒｉｕｍ 屬菌
株構 建 了 系 統 發 育 樹 （ 圖 ４ ）， 分 別 以 Ｃ．ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＣＢＳ１１２９９９ 和 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ ＮＲＲＬ２９１６９ 為外組， 結果表明， 炭疽類菌株與已報道的盤長孢狀刺盤孢 Ｃ． ｏｒｃｈｉｄｅａｒｕｍ 類群構成了明顯的分支， 並且相似性達到 ９９％， 鐮刀類菌株與 Ｆ．ｓｏｌａｎｉ 類聚， 且相似性達到了 ９８％。
圖 ４ 虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢的序列前進演化樹
因此， 根據形態和分子鑒定結果， 確診造成蝴蝶蘭黑頭病的炭疽類病原菌為虎頭蘭刺盤孢（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｃｈｉｄｅａｒｕｍ Ａｌｌｅｓｃｈ ｆ.Ｃｙｍｂｉｄｉｉ Ａｌｌｅｓｃｈ） ，造成蝴蝶蘭黑頭病的鐮刀類病原菌為茄病鐮孢（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｆ. ｓｐ. Ｆａｂａｅ Ｙｕ ｅｔ Ｃ. Ｔ. Ｆｅｎｇ）。
３ 虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢引起的蝴蝶蘭黑頭病的發生率
從杭州蘭派農業科技有限公司、 杭州百盛精準農業有限公司和浙江啟美生態農業有限公司等蝴蝶蘭基地分別采集黑頭病樣品數十份， 鏡檢並分離培養病原物。 發現由 Ｃ． ｏｒｃｈｉｄｅａｒｕｍ 引起的黑頭病發生率最大， 為 ６２. ５％以上， 而由 Ｆ． ｓｏｌａｎｉ 引起的黑頭病的發生率在 １４. ８％ ～ ３７. ５％ （表 １）。 其中Ｆ． ｓｏｌａｎｉ 引起的黑頭病主要發生在蝴蝶蘭苗期， 其發生的比例明顯高於成株期。 個別樣品的病斑則由其他病原引起， 還有待進一步驗證。
表 １ 虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢引起的蝴蝶蘭黑頭病的發生率
４ 蝴蝶蘭品種對黑頭病的抗性差異
２０２１ 年 １１ 月， 隨機調查了 ２１ 個蝴蝶蘭品種的黑頭病發生情況 （表 ２）， 發現 ５ 個大花型中，金橘、 仙桃、 富樂夕陽的發病率為 ０， 無黑頭病，為抗性品種。 而 １６ 個中小花型中僅紅粉佳人、 雪玉未發生黑頭病， 其余品種均有不同程度的病害發生。
表 ２ 蝴蝶蘭品種黑頭病發現情況調查
５ 蝴蝶蘭黑頭病的發生流行規律
在溫室大棚內， 由虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢引起的蝴蝶蘭黑頭病具有相似的發生和流行規律， 其主要以菌絲體和分生孢子器在病原組織內越冬， 經農事操作和水滴氣流的傳播擴散。 在蝴蝶蘭整個生產過程均可發病， 植株在傷口、 高溫高濕、 澆水過量或當頭淋澆、 排水通風不暢等情況下容易被誘發。
蝴蝶蘭黑頭病中， 由虎頭蘭刺盤孢侵染引起的炭疽類黑頭病占多數， 由茄病鐮孢引起的鐮刀類黑頭病占小部份。 虎頭蘭刺盤孢以傷口侵入為主， 具有較長時間的潛伏期， 周年發病。 可從氣生根或花梗抽出在葉柄上形成傷口入侵， 為病害發生高峰期， 該時期為預防炭疽病的關鍵時期。 茄病鐮孢從肉質根系或傷口侵入， 植株長勢弱、 基質帶菌和通風排水不暢等情況下易誘發病害， 以苗期發病為主。 蝴蝶蘭黑頭病 ３—１０ 月均可發生， 春秋季棚內溫濕度高， 為黑頭病發生的主要時期， 提早做好病害的預防， 控溫通氣， 降低棚內濕度， 是防控病害的關鍵。
６ 蝴蝶蘭黑頭病的綜合防治技術
６. １ 選用抗病品種
從杭州市 ３ 家蝴蝶蘭生產企業調查情況看， 目前生產上常用的蝴蝶蘭品種中易感品種為雙色鳥、三色鳥、 甜格格、 ＬＬ２９、 大黃蜂、 明日之星等，在生產中需謹慎使用。
６. ２ 把好基質和種植關
基質材料需充分消毒滅菌， 減少病原菌的攜帶。 蝴蝶蘭小苗換盆時要淺栽， 裸露莖基， 基質切勿沒過植株莖基部。
６. ３ 正確澆水和通風
換盆後一個月內應控制水分， 養護過程忌大水漫灌， 或從當頭灌澆， 需從花盆邊緣澆入。 選擇晴天澆水， 每次澆透水後開啟風扇增加空氣流通， 降低局部濕度。
６. ４ 及時清理病源
平時加強巡園， 及時清除植株上的老葉、 病葉、 枯枝、 凍害或灼傷的葉片， 隔離或清除傳染源。 發現病葉應剪除， 在傷口塗抹殺菌劑。 若發病嚴重時， 則整株清除。
６. ５ 合理施肥和溫濕度管理
施肥遵循 「少量多次、 薄肥勤施」 的原則，出瓶後 ５～７ 個月適當降低氮肥比例， 催花前 １ 個月開始提高磷鉀比例； 苗期溫度 ２６～３０ ℃， 催花期溫度 １８～２５ ℃； 濕度 ６０％～８０％為宜， 環境濕度達到 ９０％以上時， 開啟內迴圈， 加強空氣流動。
６. ６ 減少傷口產生
裝箱前需控水， 防止因基質過濕引起紙箱潮濕變軟， 造成紙箱塌陷， 壓傷植株。 在運輸過程中需輕拿輕放， 防止出現大量傷口。
６. ７ 適時化學防治
以防為主。 換盆前後噴灑廣譜性殺菌劑， 第一次澆灌肥水可與廣譜性殺菌藥物同時施用， 如亮盾（精甲·咯菌腈） 懸浮種衣劑 ２ ０００ 倍液， 之後每２ 周噴施 １ 次廣譜性殺菌劑； 抽梗時蝴蝶蘭莖基部產生較大傷口， 易感品種在長出花梗過程中易出現發病高峰期， 催花前後為防控關鍵期， 可用 ４５０ｇ·Ｌ－１咪鮮胺微乳劑 １ ０００ 倍液、 ３０％吡唑醚菌酯乳油 ２ ０００ 倍液、 ２５％苯醚溴菌清可濕性粉劑 ６００倍液中的 １～２ 種藥劑， ５～７ ｄ 噴 １ 次， 連噴 ３ 次。各種藥劑要交替使用， 以防病菌產生抗藥性。 換盆或運輸蘭株前後可噴藥 １ 次， 進行預防。
基金專案： 浙江省農業重大技術協同推廣計劃 （２０２１ＸＴＴＧＨＨ０２）
