編譯：微科盟公蝦米，編輯：微科盟Tracy、江舜堯。
微科盟原創微文，歡迎轉發轉載，轉載須註明來源【代謝組metabolome】公眾號。
導讀
安化黑茶(DTs)，包括天尖茶、千兩茶、黑磚茶和茯磚茶，是中國安化縣獨特的發酵茶；然而，它們的化學成分差異仍不清楚。本研究采用代謝組學、揮發組學和電子感官評價等方法，對5種安化DTs的化學成分和感官特性進行了分析比較。所有這些茶都源自相同的茶原料。安化DTs之間的化學成分差異顯著，其中天尖茶差異最大。長期發酵和復雜的加工方法導致多種化合物的轉化，特別是兒茶素。18種OVA > 1的揮發性化合物是安化DTs的主要香氣貢獻者。內轉錄間隔區（ITS）和16S核糖體DNA測序顯示，散囊菌屬、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬是安化DTs的優勢微生物。此外，本研究還揭示了安化DTs與其他五種傳統茶在化學成分上的顯著差異。本研究增強了我們對安化DTs加工的認識。
亮點：
1. 對5種安化黑茶的化學成分進行了研究。
2. 使用基於代謝組學、揮發組學和電子感官的多組學分析。
3. 所有樣品都來自相同的茶原料。
4. 對安化DTs的微生物群落進行了鑒定。
5. 研究了安化DTs與其他5種茶的化學成分差異。
論文ID
原名： Insight into the chemical compositions of Anhua dark teas derived from identical tea materials: A multi-omics, electronic sensory, and microbial sequencing analysis
譯名： 深入了解來源於相同茶料的安化黑茶的化學成分：多組學、電子感官和微生物測序分析
期刊： Food Chemistry
IF： 8.8
發表時間： 2024.01
通訊作者： 朱洺誌，王坤波，劉仲華
通訊作者單位： 湖南農業大學
實驗設計
實驗結果
1. UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS對非揮發性代謝物的非靶向代謝組學分析
1.1 非揮發性代謝物概況
本研究茶葉樣品資訊及實驗方法如圖1所示。在發酵微生物的影響下，安化DTs的代謝產物發生了各種變化，形成了安化DTs獨特的化學特征。我們采用基於UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的非靶向代謝組學方法，分析了不同安化DTs的化學成分差異，並評估了安化DTs與其他5種茶的化學成分差異。根據負離子和正離子模式，我們在所有樣品中共鑒定出11,604種代謝物，根據其化學性質分類，可分為13個超類(表S2)。這13個超類包括苯丙素和聚酮(1114種，例如黃烷類、黃酮類和單寧類)、生物堿和衍生物(54種)、有機酸和衍生物(936種)、有機雜環化合物(912種)、有機氧化合物(782種)、苯類(598種)、核苷、核苷酸和類似物(157種)、有機硫化合物(53種)、有機氮化合物(46種)、木脂素類、新木脂素及其相關化合物(39種)、碳氫化合物(13種)、脂質和類脂分子(3044種)和其他(3856種)。在PCA圖中，安化DTs(紅色橢圓)和其他五種茶(綠色橢圓)的樣品可以明顯區分，表明安化DTs與其他五種茶的代謝物存在顯著差異(圖2A)。此外，FBT-H-DT（茯磚茶）、FBT-M-DT（機制茯磚茶）、HBT-DT（黑磚茶）、QLT -DT（千兩茶）和TJT-DT（天尖茶）的樣品在HCA圖中被很好地區分出來，這表明這些安化DTs的代謝物存在顯著差異(圖2B)。
圖1 本研究茶葉樣品資料及實驗方法。(A)流程圖描述了生產安化黑茶和其他五種茶的生產過程。整形*：機械整形; 整形**：手工整形。藍色箭頭和紅色箭頭分別表示機壓茯磚茶和手築茯磚茶的制作過程。(B)安化黑茶和其他五種茶葉的茶葉制品和茶湯圖片。(C)本研究中使用的方法示意圖。RT:室溫;UHPLC-Q-Exactive Orbitrap- MS:超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌域阱高分辨質譜聯用;GC-QqQ-MS:氣相色譜-三重四極桿質譜;HPLC:高效液相色譜儀; GC × GC-TOF-MS:全二維氣相色譜飛行時間質譜聯用。
圖2 安化黑茶和其他5種茶的代謝組學特征和主要化學成分的含量。(A-B) 超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌域阱高分辨質譜法檢測安化DTs和其他5種茶的代謝物的主成分分析(PCA)得分圖(A)和層次聚類分析(HCA)圖(B)。在PCA圖中，紅色橢圓代表安化DTs，綠色橢圓代表其他五種茶。(C)安化DTs和其他5種茶的代表性黃酮。(D)安化DTs和其他5種茶的水萃取物、茶多酚和總遊離胺基酸含量(%)。(E-H)兒茶素 (mg/g)、沒食子酸(mg/g)、咖啡因和可可堿(mg/g)、茶胺酸(%)含量。(I) 13種胺基酸含量熱圖。同一化合物和柱狀圖前不同字母表示顯著差異(單因素變方分析; P < 0.05)。
本研究調查了安化DTs與其他5種茶之間的關系(表S3)。TJT-DT是安化DTs中發酵程度最低、工藝最簡單的DTs。我們統計了TJT-DT與其他安化DTs之間的差異代謝物（DAMs）。我們將TJT-DT與QLT-DT、FBT-M-DT、FBT-H-DT和HBT-DT進行比較，分別觀測到331、323、287和294種DAMs。TJT-DT中大部份遊離胺基酸(如茶胺酸和谷胺酸)含量高於其他安化DTs，二肽、三肽以及部份胺基酸衍生物含量低於其他安化DTs。這一結果與前人研究結果一致，即微生物發酵後的普洱茶中胺基酸及其衍生物含量下降，真菌還參與了蛋白質和寡肽類化合物的代謝。此外，與TJT-DT相比，QLT-DT中大多數脂質和類脂分子(如脂肪酰基、聚酮類化合物和甘油磷脂)、苯丙素類和聚酮類(如黃烷、類黃酮苷、異類黃酮)、有機酸及其衍生物的含量更高。與TJT-DT相比，FBT-M-DT和FBT-H-DT（手築茯磚茶）中大多數類黃酮苷、聚酮、甘油磷脂、脂肪酰基和有機雜環化合物(如嘌呤和嘌呤衍生物)的含量較高，而大多數黃烷類化合物(如表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和一些茶黃素衍生物)的含量較低。大多數脂類和類脂分子(如脂肪酰基、甘油磷脂、萜苷類和倍半萜類)的含量較低，而某些類黃酮、類黃酮苷和黃烷類成分含量高於TJT-DT。這些結果表明，與TJT-DT相比，QLT-DT、FBT-M-DT、FBT-HDT和HBT-DT中的長期發酵或復雜處理方法導致某些化合物水平升高，特別是聚酮、生物類黃酮和聚類黃酮化合物，前期的文獻也報道過類似的結果。
我們利用OPLS-DA將安化DTs與OT（烏龍茶）、YT（黃茶）、WT（白茶）、BT（紅茶）和GT（綠茶）進行比較，分別鑒定出335、295、287、257和222種DAMs (VIP > 2, P < 0.01)。安化DTs中大部份有機酸及其衍生物、脂類及類脂分子(主要為脂肪酰基、聚酮類和甘油磷脂類)、苯丙類和聚酮類(主要為類黃酮苷類)含量上調，胺基酸、多肽、黃酮類、黃酮類和類黃酮苷類含量下調。這些結果表明，微生物在安化DTs中發酵導致蛋白質降解為小肽，胺基酸和黃酮類化合物轉化，並形成類脂化合物。
1.2 全球天然產物分子網絡系統(GNPS)分子網絡分析
GNPS數據庫能夠根據譜庫對質譜結果進行搜尋，以辨識已知的天然產物並行現其變體。透過GNPS分子網絡分析，我們可以探討光譜的相似性和差異。如圖3A所示，以TJT-DT作為安化DTs的代表，我們在安化DTs和其他5種茶的分子網絡中共發現了1914個節點。具有相似結構的光譜透過線連線形成代謝簇，如苯丙類和聚酮類，脂類和類脂分子(用實線圈標記)，為從已知光譜資訊中發現新化合物提供了一種方法。例如，一些未知光譜(例如，m/z: 745.139, 751.104和783.115)被認為是茶黃素衍生物，因為這些未知光譜和茶黃素3-沒食子酸酯在同一個代謝簇中。在TJT-DT、BT、WT、OT、GT和YT中分別鑒定出45、40、8、5、2和0個特有光譜(用虛線圈標記)。結果表明，與其他5種茶葉相比，安化DTs具有更多的特異性代謝物，這可能與微生物發酵有關。然而，這些光譜尚未被很好地辨識。這些特異光譜的結構分析有助於在6種茶葉中，特別是在安化DTs中發現新的風味和保健相關的標記化合物。
如圖3B所示，我們將5個安化DTs樣本進行GNPS分析，探討安化DTs之間的光譜相似性和差異性。在5個安化DTs的分子網絡中共觀察到2065個節點。多種化合物，如苯丙素和聚酮、脂類和類脂分子、有機酸和衍生物以及有機氧化合物，用線連線起來形成代謝簇(用實線圈標記)。值得註意的是，我們在TJT-DT、FBTH-DT、FBT-M -DT和QLT -DT中發現了少量的特有光譜(分別為11、4、8和6個)，而在HBT-DT中發現了大量的特有光譜(用虛線圈標記)。這表明HBT-DT與其他安化DTs在非揮發性代謝物方面存在顯著差異，這解釋了在PCA和HCA圖中HBT-DT與其他安化DTs的顯著分離。
圖3 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS法檢測安化DTs(A)以及安化DTs與其他5種茶(B)之間代謝物的分子網絡。不同茶葉樣品的特征代謝物用不同顏色的虛線橢圓聚類。TJT-DT:天尖茶;QLT-DT:千兩茶;HPT-DT:黑磚茶;FBT-H-DT:手築茯磚茶;FBT-M-DT:機制茯磚茶;BT:紅茶;GT:綠茶;YT:黃茶;WT:白茶;OT:烏龍茶;PPPs:苯丙素和聚酮類化合物;LLLMs:脂質和類脂分子;OOCs:有機氧化合物;OADs:有機酸及其衍生物。
1.3 黃烷類成分的轉化
黃烷類成分是茶葉中最豐富的多酚類物質，是茶中有益健康和口感的主要貢獻者。安化DTs中黃酮類化合物的轉化越來越受到關註。在本研究中，我們共鑒定出76種黃烷類成分，且每種茶都有特有的黃烷類成分(表S4)。其他5種茶和安化DTs中具有代表性的黃烷類成分如下(圖2C): GT（綠茶）中含有高含量的單體兒茶素衍生物，如EGCG、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)和沒食子兒茶素(GC)；BT和OT中茶黃素及其衍生物，包括茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯和異茶黃素含量較高；WT中聚合兒茶素衍生物含量較高，如assamicain A和C, 4-β-(2-胺基乙硫基)，ECG和3,5-digalloylepicatechin；相比之下，安化DTs中大多數黃烷類成分含量較低，這可能與微生物作用下的復雜轉化有關。
我們對安化DTs中類黃酮化合物的微生物轉化產物進行了研究。近年來，研究者在安化DTs中發現了多種轉化產物，如黃烷-3-醇B環裂變類似物和8-C N-乙基-2-吡咯烷酮取代黃烷-3-醇(EPSFs)。這些黃烷- 3-醇B環裂變類似物包括fuzhuanins A (ID 1640)和D (ID 1467)(表S4)。除QLT -DT外，安化DTs中fuzhuanins A的含量高於其他5種茶；安化DTs中fuzhuanins D的含量高於其他5種茶。安化DTs中fuzhuanins A和D的含量高，主要是由微生物轉化所致。FBT-M-DT和FBT-H-DT中的fuzhuanins A含量高於HBT-DT、QLT-DT和TJT-DT；FBT-M-DT中fuzhuanins D的含量也高於其他安化DTs。因此，FBT-DT的長時間「發花」過程促進了fuzhuanins A和D的形成。EPSFs包括EGC-cThea (ID 1494)和EC-cThea (ID 1268)。前期研究發現，EPSFs是由黃烷-3-醇和茶胺酸聚合形成的。近年來，人們發現EPSFs與儲存時間密切相關，並將其作為預測白茶、普洱茶和綠茶儲存時間的標記化合物。值得註意的是，除HBT-DT外，安化DTs中EGC-cThea含量顯著高於其他5種茶；安化DTs中EC-cThea的含量明顯高於其他5種茶。這些結果表明，發酵微生物可能促進了EPSFs的合成。因此，EGC-cThea和EC-cThea可以作為安化DTs的標記化合物。
2. 非揮發性代謝物的靶向代謝組學分析
本研究針對水萃取物、茶多酚、兒茶素、沒食子酸(GA)、生物堿(咖啡因和可可堿)、茶胺酸等13種遊離胺基酸進行檢測(圖2D-I，表S5)。QLT -DT、HBT-DT、FBT-H-DT、FBT-M-DT的水提物含量差異不大，但顯著低於TJT-DT；除TJT-DT外，安化DTs的水提物含量高於BT，低於GT、YT、WT和OT。QLT-DT、HBT-DT、FBT-H-DT和FBT-M -DT中的茶多酚含量也低於TJT-DT；除FBT-H-DT外，安化DTs多酚含量均高於BT，低於GT、YT、WT和OT。與水提物和茶多酚含量相似，TJT-DT中總兒茶素含量高於其他安化DTs萃取物，也高於BT，但低於GT、YT、WT和OT。此外，安化DTs萃取物中的總兒茶素含量比GT降低了約50 - 60%。水浸出物含量是茶湯濃郁度的重要指標。以兒茶素為主要成分的多酚是茶葉中主要的次生代謝產物，占茶葉幹重的8 - 26%。安化DTs和BT的水萃取物、茶多酚和總兒茶素含量低，可分別歸因於微生物轉化和酶轉化；對於安化DTs中TJT-DT的水浸提物、茶多酚和總兒茶素含量較高，可歸因於發酵程度低和加工方法簡單。
兒茶素被認為是對健康有益和茶的苦味和澀味的重要貢獻者。安化DTs的EGCG和ECG含量高於BT，但分別為GT、YT、WT和OT的0.78 - 51.73%和6.04 - 68.48%。然而，與EGCG和ECG含量相比，安化DTs與4種茶(GT、YT、WT、OT)的EGC含量差異較小。安化DTs中GA含量顯著高於其他5種茶。同時，FBT-H-DT和FBT-M-DT中EGCG含量極低於其他安化DTs，而FBT-H-DT和FBT-M-DT中GA含量顯著高於其他安化DTs。以上結果表明，沒食子兒茶素(如EGCG和ECG)被水解為非沒食子兒茶素(如EGC和EC)。在發酵微生物的作用下，安化DTs中的EGCG和EGC含量較低，而BT中的EGCG和EGC含量較低是由於酶的氧化作用引起的。此外，與其他安化DTs相比，FBT-H-DT和FBT-M-DT中獨特的「發花」過程使沒食子酸兒茶素的水解更強。
咖啡因是茶中主要的生物堿，是茶的苦味和對健康有益的主要貢獻者。與兒茶素不同，所有茶中咖啡因的含量相對穩定。盡管如此，安化DTs中咖啡因的含量仍略低於GT、WT和OT。這表明安化DTs和BT是咖啡因敏感人群的良好選擇。遊離胺基酸通常被用作優質茶葉品質的指標。茶胺酸約占遊離胺基酸的50%，對茶的鮮味至關重要。安化DTs中的茶胺酸含量和遊離胺基酸總含量低於GT、YT、WT和OT。對於安化DTs，TJT-DT中的茶胺酸和總遊離胺基酸含量高於其他安化DTs。因此，微生物發酵導致了安化DTs中茶胺酸和總遊離胺基酸的顯著減少；對於安化DTs, TJT-DT中茶胺酸和總遊離胺基酸含量較高歸因於發酵程度低，加工方法簡單，與水提物、茶多酚和總兒茶素含量變化相似。前期研究已經證明，胺基酸可以透過發酵微生物轉化為揮發性化合物和兒茶素胺基酸聚合物。胺基酸的轉化對安化DTs的風味和保健作用有重要影響。
3. 利用GC × GC-TOF-MS對揮發性代謝物進行非靶向揮發組學分析
本研究采用HS-SPME-GC × GC-TOF-MS測定揮發性代謝物。我們共鑒定出638種揮發性化合物(表S6)。PCA圖顯示，安化DTs、GT、YT樣本與BT、OT、WT樣本分離明顯，但安化DTs與GT、YT樣本分離不明顯(圖4A)。此外，HCA圖與PCA圖顯示出相同的結果。前期研究表明，BT和WT中揮發性代謝物的濃度與其他茶種相差較大，這與我們的研究結果相似(圖4B)。安化DTs、GT和YT經過了固定處理，而BT、OT和WT在加工或發酵前不需要殺青，殺青過程對6種茶的揮發性代謝物有顯著影響。本研究考察了安化DTs與其他5種茶之間的差異積累的揮發性化合物（DAVOCs）(圖4C, 表 S7/Sheet1)，基於OPLS-DA模型發現DAVOCs 77種(VIP > 1, P < 0.05)，這77種DAVOCs可作為區分安化DTs與其他5種茶的特征化合物：其中，6,10-二甲基-5,9-十一雙烯-2-酮、乙酸丁酯、乙酸、苯酚、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3-丁二酮、2,3-辛二酮和四甲基吡嗪等15種DAVOCs的含量在安化DTs中顯著高於其他5種茶。這15種DAVOCs散發著果香、刺激性氣味、花香、茉莉香，構成了安化DTs的獨特香氣。然而，安化DTs中其他62種DAVOCs的含量低於WT、OT和BT，這62種揮發性代謝物占DAVOCs的大部份。因此，與WT、OT和BT相比，安化DTs整體上具有較低的揮發性代謝物濃度，這與之前的研究相似。
本研究還篩選了5種安化DTs之間的DAVOCs(圖4D，表S7/Sheet2)。如圖4D所示，TJT-DT與其他4種安化DTs在揮發性代謝物方面存在較大差異。共有62種DAVOCs可作為區分TJT-DT與其他安化DTs的特征化合物。大多數DAVOCs(62種中有50種)在TJT-DT中的含量高於其他安化DTs，這表明，與TJT-DT相比，QLT -DT、HBT-DT、FBT-H-DT和FBT-M-DT經過長時間發酵或復雜的加工方法導致了大多數DAVOCs的降解。相比之下，QLT -DT、HBT-DT、FBT-H-DT和FBT-M-DT中11種DAVOCs的含量高於TJT-DT。這11種DAVOCs包括(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-氧化芳樟醇(呋喃類)、(E,E)-2,4-癸二烯醛、甲苯、藏花醛、2-甲基-1-戊烯-3-酮、(S-(R*，R*))-2,3-丁二醇、二氫獼猴桃內酯、1-辛烯-3-醇、丙酮和(S)-(-)-檸檬烯。結果表明，長時間發酵或復雜的加工方法也導致了這些揮發性化合物在QLT -DT、HBT-DT、FBT-H-DT和FBT-M-DT中的形成，使這些安化DTs具有脂肪氣、木香、花香、水果、麝香、蘑菇香、泥味和甜味。
4. GC-QqQ-MS對揮發性代謝物的靶向代謝組學分析
本研究采用HS-SPME-GC-QqQ-MS對揮發性代謝物進行了針對性測定。我們在安化DTs共檢測到51種揮發性化合物，其中酮類15種，醛類13種，醇類10種，酯類5種，methoxybenzenes 3種，芳烴類3種，酚類2種(表S8)。PCA圖顯示，安化DTs、GT和YT可以從BT、OT和WT中分離出來，但安化DTs不能從GT和YT中分離出來，這與GC × GC- TOF -MS的結果一致(圖4E)。此外，BT的總揮發性代謝物含量最高，其次是WT、OT、安化DTs (平均)、YT和GT，這與之前的報道相吻合。與WT、OT和BT相比，安化DTs、YT和GT的揮發性代謝物整體含量較低，說明酶轉化在揮發性代謝物合成中的效率更高。此外，與GC × GC- TOF -MS的結果相似，靶向分析也證明了安化DTs、GT、YT的揮發性成分具有一定的相似性。這表明安化DTs、GT和YT共有的固定過程對茶葉揮發性代謝物有重要影響。
我們比較了安化DTs不同品種之間的揮發性代謝物含量。PCA結果表明，5個安化DTs之間存在明顯的分離(圖4E)，突出了發酵過程和發酵微生物的重要性。靶代謝組學分析表明，FBT-M-DT、FBT-H-DT、HBT-DT和QLT -DT的總揮發性代謝物含量高於TJT-DT。然而，我們的非靶向代謝組學結果顯示，TJT-DT中大多數DAVOCs的相對含量高於其他安化DTs，這意味著非靶向和靶向代謝組學結果可能是矛盾的。這是因為受到檢測能力的限制，這些揮發性代謝物無法透過靶向代謝組學檢測並進行絕對定量。這些揮發性代謝物大多是低沸點物質，在後續加工過程中揮發，從而導致FBT-MDT、FBT-H-DT、HBT-DT和QLT -DT的相對豐度明顯低於TJT-DT。此外，根據代謝組學分析，TJT-DT中一些揮發性化合物的含量低於其他安化DTs。這些揮發性化合物包括二氫獼猴桃內酯、水楊酸甲酯、棕櫚酸甲酯、1,2,3-三甲氧基苯、植物蛋白腖、(E,E)-2,4-庚二烯醛、己醛和氧化芳樟醇2。與其他安化DTs相比，二氫獼猴桃內酯是造成TJT-DT中總揮發性代謝物含量較低的主要原因。FBT-M-DT和FBT-H-DT中揮發性成分的顯著增加可能與微生物參與「發花」步驟有關。
揮發性化合物對茶葉香氣的最終貢獻取決於其氣味活性值(OAV)。我們在安化DTs和其他5種茶中共檢測到22種OAV > 1的揮發性化合物(表S9)，其中14種化合物的OAV在所有樣品中均大於1。前人的研究認為這14種化合物是茶葉中重要的香氣成分。其中，α-甲基萘(藥香，OAV = 51.16)和雪松醇(木香，OAV = 16.13)在QLT -DT中的OAV最高；在HBT-DT中，藏花醛(OAV = 3.8，藥香和木香)的OAV最高；1,2,3-三甲氧基苯(OAV = 72.03，藥香、木香和陳香)和1,2,4-三甲氧基苯(OAV = 7.01，木香和陳香)在FBT-H-DT中的OAV最高。此外，α-紫羅蘭酮(OAV = 25.24，花香和甜香)、β-紫羅蘭酮(OAV = 551.11，花香和果香)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(OAV = 53.57，果香和甜香)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(OAV = 40.29，花香、果香和脂肪氣)、檸檬醛2 (OAV = 9.43，果香)、己醛(OAV = 67.23，果香和生青味)和苯乙醇(OAV = 27.4，果香和甜香)在BT中的OAV最高；β-環檸檬醛(OAV = 2.8，花香和果香)在OT中的OAV最高;在WT中，芳樟醇(OAV = 20.86，花香和果香)的OAV最高。因此，這些化合物的OAVs決定了不同類別茶葉的香氣。
值得註意的是，8種OAVs > 1的化合物僅在某些類別的茶葉中出現。二氫獼猴桃內酯的OAV > 1 (OAV = 1.03)，僅在FBT-M-DT中存在，使FBT-M-DT具有麝香和果香。庚醛在HBT-DT (OAV = 1.02)、FBT-H-DT (OAV = 1.65)和BT (OAV = 1.11)中OAV > 1，表現出強烈的令人不愉快的脂肪氣味。除BT、QLT -DT和FBT-M-DT外，1-辛-3-醇在所有樣品中的OAV均> 1 (OAV = 1.27 ~ 5.24)，並產生生青味、蘑菇香和泥味。除GT、YT和WT外，(E, E)-2,4-庚二烯醛在所有茶葉樣品中的OAV > 1 (OAV = 1.32-2.82，脂肪氣味)。2-戊基呋喃在GT (OAV = 1.38)、WT (OAV = 2.4)、OT (OAV = 4.88)和BT (OAV = 2.07)中的OAV > 1，並表現出果香、生青味和堅果香。(E)-2-己烯醛在WT (OAV = 3.74)和BT (OAV = 15.26)中的OAV均> 1，使得WT和BT具有生青味、果香、辛辣和類似蔬菜味。(E)-橙花叔醇在OT (OAV = 4.02)和BT (OAV = 2.0)中的OAV均> 1，使得OT和BT具有花香、果香和甜香。苯乙醛僅在BT中OAV > 1 (OAV = 2.36，蜜香，類似玫瑰香和甜香)。這些OAV結果表明，安化DTs具有多種藥香、木香、脂肪氣、麝香和陳香，而其他5種茶具有更濃郁的花香、甜香和果香。
5. 氣相色譜-質譜法分析脂肪酸代謝組學
脂肪酸(主要是中鏈和長鏈脂肪酸)是茶葉重要的香氣前體物質，可降解為C6-C9揮發性醇、醛、酮和酯，並具有甜香或花香。因此，脂肪酸(如亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸和油酸)的降解與茶葉的香氣品質密切相關。本研究采用氣相色譜-質譜法對22種脂肪酸進行絕對定量測定(表S10)。高度發酵後的FBT-M-DT和FBT-H-DT中總脂肪酸含量顯著低於普通發酵的QLT -DT、TJT-DT和HBT-DT(圖4F)。這表明FBT-DT在「發花」過程中大量消耗脂肪酸，這與Zhu等人的觀點一致。因此，微生物發酵有助於DT中獨特香氣的形成。此外，高度發酵後的FBT-M-DT和FBT-H-DT的總脂肪酸含量也明顯低於GT和YT，但與BT、WT和OT的差異較小(圖4F)。這表明，與微生物發酵過程類似，BT、WT和OT的酶解過程對脂肪酸的降解有顯著影響，而GT和YT的處理對脂肪酸的降解影響相對較小。此外，本研究還分析了13種脂肪酸衍生揮發物與脂肪酸的相關性(表S11)。結果表明，這些脂肪酸衍生揮發物的含量與脂肪酸含量呈極顯著負相關(Spearman系數= -0.64,n = 30, P < 0.01)。Chen 等人發現脂肪酸的降解在BT的脂肪酸衍生揮發物的生成中起著至關重要的作用，我們的研究結果證明，這一結論同樣適用於所有6種茶葉，說明了脂肪酸降解對茶葉香氣的影響。
圖4 安化DTs與其他5種茶的揮發性成分及香氣特征比較。(A-B) GC × GC-TOF-MS檢測的安化DTs和其他5種茶葉揮發性成分的PCA得分圖(A)和層次聚類分析(HCA)圖(B)。在PCA圖中，紅色橢圓表示安化DTs。(C) 安化DTs與其他5種茶的差異累積揮發性成分相對含量熱圖；(D) 安化DTs之間的差異累積揮發性成分相對含量熱圖；(E)GC法檢測安化DTs和其他5種茶的PCA得分圖。紅色橢圓代表安化DTs，綠色橢圓代表其他5種茶。(F)中、長鏈脂肪酸總含量(μg/g)。
6. 安化DTs微生物群落研究
發酵微生物在安化DTs品質的形成中起著不可或缺的作用，它們參與了各種化學成分的分解、合成和轉化。此外，發酵後的安化DTs中仍存在部份發酵微生物，這對安化DTs的食用安全性有重大影響。因此，我們透過高通量ITS和16S rDNA擴增子測序，分析了安化DTs的真菌和細菌群落。我們在5個安化DTs中共鑒定出真菌群落5門12綱25目37科46屬，細菌群落27門57綱120目197科291屬。本研究在TJT-DT、QLT-DT、HBT-DT、FBT-M-DT和FBT-H-DT中分別註釋了18、26、11、21和39個真菌屬和76、144、61、118和114個細菌屬。這些結果表明了安化DTs中存在較高的微生物多樣性。此外，散囊菌屬、 Blastobotrys 、枝孢屬、附球菌屬、節擔菌屬、 Saitozyma 、念珠菌屬、古根菌屬、鏈格孢屬和紅菇屬是5個安化DTs中排名前10位的真菌屬(圖5A，表S12)。值得註意的是，散囊菌屬是絕對優勢真菌屬，占5個安化DTs的93.04 - 99.30%。已有研究證明，FBT-DT中的散囊菌屬主要鑒定為冠突散囊菌。因此，本研究推測FBT-M-DT和FBT-H-DT中的散囊菌屬主要為冠突散囊菌。
排名前10的細菌屬分別是假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、考克氏菌屬、不動桿菌屬、小球菌屬、李斯特菌屬、短桿菌屬、埃希菌屬和擬桿菌屬(圖5B，表S12)。這些細菌在之前的DTs研究中已經發現，但它們的豐度在不同的研究中差異很大。假單胞菌屬和芽孢桿菌屬為優勢菌，占本研究全部序列的5.56 ~ 36.99%。假單胞菌屬、芽孢桿菌屬在自然環境中無處不在。一些假單胞菌屬具有抗炎作用，透過降解有害物質(如農藥殘留和芳香化合物)來進行解毒作用，還可以透過代謝乳酸和競爭性抑制腸道有害細菌的生長來調節腸道。芽孢桿菌屬是腸道中重要的有益菌，常被用作益生菌。因此，假單胞菌屬和芽孢桿菌屬不僅對安化DTs的感官品質有顯著影響，而且可能在安化DTs的潛在健康益處中發揮至關重要的作用。此外，HBT-DT中細菌的相對豐度與其他安化DTs有顯著差異。HBT-DT中的擬桿菌屬相對含量高於其他安化DTs。這些結果表明細菌可能是導致HBT-DT與其他安化DTs之間代謝物差異較大的因素之一。
為了探索安化DTs中發酵微生物與代謝物之間的潛在相關性，我們透過Pearson相關分析構建了安化DTs中排名前10位的微生物(細菌和真菌)與DAMs的關聯網絡(圖5C)。排名前10的真菌屬在安化DTs代謝產物轉化中發揮了重要作用，這與前期研究相似。值得註意的是，在各種安化DTs中，細菌與DAMs之間存在很強的相關性，特別是與脂類和類脂分子以及苯丙素和聚酮類成分。這一發現表明，細菌也對不同安化DTs代謝產物的改變有顯著影響。
7. 電子感官特性及其與化學成分的關系
電子傳感器技術是感官評估的重要方法，與人類相比，它提供了更敏感、數碼化和客觀的感官特征描述。我們采用電子眼、電子舌、電子鼻聯合套用，綜合評價安化DTs的香氣、茶湯口感、茶湯顏色。此外，本研究還分析了電子感官特性與化學成分之間的相關性。
7.1 電子鼻分析
雷達圖顯示了電子鼻響應值。在安化DTs中，傳感器P40/1、T70/ 2和P30/1的響應值變化較小，而在FBT-M-DT和FBT-H-DT中，傳感器LY2/G、LY2g/CT和PA/2的響應值明顯低於其他安化DTs (圖5D)。此外，我們選擇TJT-DT作為安化DTs的代表，與其他5種茶進行電子鼻響應值的差異比較(圖5E)。傳感器PA/2、LY2/ gCT和LY2/G在TJT-DT和GT中的響應值顯著高於其他茶種。傳感器PA/2、LY2/gCT和LY2/G對乙醇、氨水、胺、丙烷、丁烷、碳和含氧化合物敏感，表明TJT-DT和GT之間這些化合物的組成和含量可能相似。T70/2和P30/1傳感器對OT、WT和YT的香氣化合物更為敏感，可捕獲甲苯、二甲苯、一氧化碳、碳氫化合物、氨和乙醇相關化合物。PCA圖進一步說明了電子鼻傳感器與各種茶葉樣品之間的相關性(圖5F)。電子鼻傳感器與揮發性化合物之間的關系在圖5G-H上進一步闡明。結果表明，T70/2、LY2/G和LY2/gCT傳感器對安化DTs中揮發性化合物更為敏感(圖5G)。此外，PA/2、LY2/ gCT和T70/2傳感器對TJT-DT和其他5種茶之間揮發性化合物的反應更為敏感(圖5H)。
圖5 安化DTs微生物群落及電子鼻傳感器與GC-QqQ-MS檢測DAVOCs的相關性(A-B)安化DTs中排名前10真菌屬(A)和細菌屬(B)的相對豐度。(C) 透過 Pearson 相關分析，分析安化 DTs 中差異積累代謝物與真菌和細菌之間的關系（|系數| ≥ 0.85 且 P < 0.05）。紅線表示正相關，藍線表示負相關。(D-E)安化DTs(D)以及安化DTs與其他5種茶(E)之間的電子鼻傳感器響應得分。(F)電子鼻傳感器與不同茶葉樣品的PCA雙標圖。(G)安化DTs之間電子鼻傳感器與DAVOCs的相關性分析；(H)安化DTs與其他5種茶的電子鼻傳感器與DAVOCs的相關性分析。
7.2 電子舌分析
雷達圖顯示了電子舌的特征，包括酸味、苦味、苦的回味、澀味、澀的回味、鮮味、濃郁度、鹹味和甜味(圖6A，表S13)。安化DTs的苦味強度較高，FBT-M-DT和FBT-H-DT的苦味強度最高，而除BT外，其他種類的茶的苦味強度都低於安化DTs，所有樣品的苦的回味值趨勢與苦味相似。GT中的澀味和澀的回味強度高於其他茶葉樣品，這可能是由於GT中多酚和兒茶素含量較高引起的。與其他8種茶相比，BT和FBT-M-DT的鮮味強度較低，而其他8種茶的差異很小。BT 中的濃郁度最低，這與 BT 中水萃取物的含量最低一致。與其他茶樣品相比，GT、YT、WT 和 OT 的鹹味強度較高。安化DTs和BT的甜度值高於GT、YT、WT和OT。此外，這些結果也直觀地顯示在 PCA 雙標圖中（圖 6B）。
大量的味覺化合物相互作用，構建了茶湯迷人而復雜的味覺特征。透過TJT-DT與其他安化DTs、TJT-DT與其他5種茶的比較，我們從OPLS-DA模型中分別篩選出差異性非揮發性代謝物288和346種(VIP > 2, P < 0.01)，它們可作為特征性代謝物(表S14)，隨後透過PLSR模型分析這些差異的非揮發性代謝物與電子舌味覺特征的相關性(圖6C-D)。每個數碼代表一種代謝物，代謝物的序號與名稱的對應關系見表S14。如圖6C所示，安化DTs的代謝物大部份位於x軸右側，與苦味、苦的回味、甜度、濃郁度、酸味呈正相關，這些代謝物包括大部份木脂素、新木脂素及其相關化合物和有機雜環化合物。此外，安化DTs的鮮味、鹹味、澀味和澀的回味的味覺特征彼此靠近。這些味覺特征與部份木脂素、新木脂素及其相關化合物、有機雜環化合物、有機酸及其衍生物(如茶胺酸，No.34；2-胺基庚二酸，No.1683；甘胺酸No.580；和谷胺酸，No.133)和大多數核苷、核苷酸和類似物、有機氧化合物、苯丙素和聚酮類化合物(例如EGCG，No.414；芹糖異甘草苷, No.1112；EGC-(4β→8)-C, No.193；isoneotheaflavin-3-O-gallate, No.623；EC-(4β→8)- EGC -3-O-gallate, No. 344；原翠雀素 B, No. 1660)正相關。因此，PLSR模型清楚地說明了安化DTs中特征代謝物的味道特征。TJT-DT與其他5種茶的差異非揮發性代謝物和口感特征的相關性顯示在圖6D中。這些結果有助於揭示代謝物對茶湯口感特征的綜合影響。
圖6 安化DTs與其他5種茶的口感特征與代謝物的關系。(A)電子舌探測到的味覺特征雷達圖。(B)味道特征與不同茶樣的PCA雙標圖。(C-D) PLSR分析安化DTs之間(C)以及安化DTs與其他5種茶之間(D)的口感特征與差異積累代謝物的相關性。Aftertaste-A:澀的回味;Aftertaste-B: 苦的回味。
7.3 電子眼分析
我們采用L*、a*、b*色標對電子眼色差進行量化(表S15)。L*表示明或暗，a*表示紅或綠，b*表示黃或藍。隨著發酵程度的增強，L*和b*值有減小的趨勢，a*值有增大的趨勢(L*和b*值的變化趨勢:GT、YT和WT > OT >安化DTs > BT；a*的變化趨勢: GT、YT、WT < OT <安化DTs< BT)。此外，不同DTs之間的L*、a*、b*值也略有差異。只有FBT-H-DT的a*值顯著高於其他DTs，說明FBT-H-DT的茶湯顏色是DTs中最紅的。GT、YT和WT的L*、a*和b*值差異較小。我們透過相關分析研究了茶湯顏色與口感特征之間的關系。結果顯示，茶湯顏色與茶的口感特征存在相關性(表S16)，說明利用電子眼可以初步判斷茶湯的口感特征。
結論
綜上所述，本研究采用基於靶向代謝組學和非靶向代謝組學的多組學方法，結合電子感官評估，系統地揭示和比較了5種安化DTs的植物化學特征和感官特征。長期發酵或復雜的加工方法導致大多數化合物的含量減少，包括兒茶素和胺基酸。非揮發性物質的變化影響了安化DTs的口感特征。18種OAV > 1的揮發性化合物是安化DTs的香氣主要貢獻者，產生脂肪氣、木香、泥味和甜香。相關分析揭示了揮發性化合物與電子鼻傳感器、非揮發性代謝物與味覺特征、茶湯顏色與味覺特征之間的關系。微生物測序結果顯示，安化 DTs 中的真菌主要是散囊菌屬，細菌主要是假單胞菌屬和芽孢桿菌屬。此外，本研究揭示了安化DTs與其他5種茶在非揮發性化合物方面的顯著差異。本研究結果為安化DTs的加工和質素控制提供了理論依據。未來的研究將利用代謝組學、宏基因組學和蛋白質組學，更深入地了解不同加工階段的代謝物、基因、微生物群落和蛋白質的變化。
