钰芯微电极@用于DNA检测的POCT微流控器件

2024-01-27健康

医学诊断技术在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着非常重要的作用。随着疾病相关的生物标志物检测策略的不断发展，基于DNA的生物传感器因为能够靶向人类、病毒和细菌的遗传信息而在临床诊断中受到越来越多的重视。

与此同时，因为具有改善患者治疗效果的潜力（例如降低医疗成本、缩短诊断周期、提高医疗服务获取的便利性等），即时诊断技术（POCT）在过去几年中获得了极大的关注。

然而，虽然现有的用于POCT的DNA生物传感器具有良好的应用前景，但是，其仍然存在某些局限性。首先，利用现有的DNA生物传感器进行DNA检测涉及多个步骤，例如样品制备、扩增和检测，并且这些步骤是分开进行的。

因此，一方面，操作的复杂性需要训练有素的人员；另一方面，系统有效运行的空间需求对其可及性提出了挑战，特别是在现场应用的情境下。更重要的是，由于在应用过程中需要昂贵的试剂和材料，其成本因素仍然是一个主要障碍。

DNA传感平台

近期，来自韩国西江大学的研究人员在知名期刊 Advanced NanoBiomed Research 上发表了题为「Point-of-Care Testing (POCT) Devices for DNA Detection: A Comprehensive Review」的综述，概述了集成DNA生物传感器的芯片实验室技术在POCT领域的发展现状。

传感平台的选择是POCT工具开发的一个基本点。传感平台应具有便携性、用户友好性和易于操作性；此外，平台还应坚固、灵活和耐用。在选择DNA检测平台作为POCT工具时，该平台应与强大的分析方法兼容，以期用最少的样本得到快速准确的结果。到目前为止，世界各国的研究人员已经成功开发了几个平台，作为DNA分析中POCT应用的工具。

微流控芯片、纸基微流控设备和侧流分析（LFA）平台被认为是POCT工具的常用选择。因此，选择平台时应根据每个应用程序中DNA检测的具体需求，通过评估目标、检测过程和测试环境，同时仔细考虑分析的目的，来选择合适的DNA传感平台。

微流控器件

微流控技术专注于使用高达数百微米规模的通道进行小规模流体的行为、操作和控制，然后发展成为一种可用于进行各种反应、分离和检测的技术。一开始，微流体装置可以用硅和玻璃基板制造，后来发展成各种选择，如陶瓷、聚合物和纸张。这些衬底材料可以通过各种方法，如层压、成型、3D打印和纳米制造，进一步成为器件。

泄漏是微流控设备的主要问题之一，可以根据具体的应用要求通过热粘合、粘合剂粘合、干粘合或溶剂粘合来解决这个问题。

微流控器件已经成为开发生物传感器的强大工具，特别是在POCT应用中。微流体通道的微尺度尺寸能够精确控制流体的流动，从而实现分析物检测的高灵敏度和特异性。对于核酸检测，微流体系统经常将微流体、核酸纯化和扩增以及检测方法的原理集成到单个设备中，从而实现复杂测定的自动化和小型化。

微流控器件的每个功能部件和流量控制单元，如流量传输、计量、阀门和开关，都必须表现出卓越和稳健的性能。在所有种类的微流体系统中，毛细管和离心力已被确定为核酸检测的极好选择，因为它们具有多功能的流体控制，不需要复杂的管路或微阀，使它们成为整合核酸和核酸的理想选择。

离心微流体技术是临床样本护理点医学测试的一种很有前途的选择，它包括各种步骤，如制备、培养、洗涤等。对于离心式微流体装置，所有这些步骤都可以在单个旋转盘上进行，在该旋转盘中，样品溶液通过产生的旋转力驱动通过微通道。离心力使流体移动，分离颗粒，混合试剂，并执行其他流体操作。

一个来自中国的科研团队开发了一种新的离心微流体平台，用于从全血样本中检测乙型肝炎病毒的DNA。该平台由一个使用聚甲基丙烯酸甲酯作为基底制成的微流体盘组成，旨在实现一个高效的系统，该系统包括样品制备和分离、裂解、DNA提取和DNA扩增，这是一个与荧光检测器集成的全自动、样品到检测结果的过程。

*用于从全血样品中检测乙型肝炎病毒DNA的离心式微流体平台的示意图

利用毛细管力的系统是微流体中最广泛使用的系统之一，为有效的流体调节提供了一种成功的被动驱动微泵送方法。另一个研究团队研发了一种被动驱动的微流体装置的开发，该装置用于通过环介导的等温扩增分析检测核酸，并在荧光显微镜下同时监测。

该系统中使用的微流体芯片没有泵和阀，并允许用户通过微量移液管调节在纳升规模上控制液滴。采用聚二甲基硅氧烷硅片刻蚀光刻技术制作了微流控平台。毛细管通道和阀门的设计在控制该系统中的流体流动方面起着至关重要的作用，允许流体的保留或通过。

*用于通过环介导等温扩增测定检测核酸的被动驱动微流体装置的示意图

侧流分析法

通常，侧流分析法（LFA）是一种基于免疫测定原理的简单快速的诊断测试。这种测定法也被称为侧流免疫测定法或条带测定法，是医疗诊断、食品安全和环境监测等各种应用中检测目标分子的一种简单且经济高效的方法。LFA通常设计为条形配置，由样品垫、结合垫、硝化纤维膜和吸收垫组成。LFA的基本原理是毛细管驱动的流体流动通过多孔NC膜，穿过条带的不同区域，沿途与特定的检测组件相互作用。

LFA中的核酸直接检测方法包括将核酸探针固定在测试和/或控制区中，这将捕获核酸靶标。互补探针通常使用链亲和素-生物素结合到NC膜上固定。Henderson等研究人员提出了一个例子，他们改进了LFA，使用23S rDNA–AuNP缀合的探针从人类粪便中检测大肠杆菌的DNA和RNA。

*侧流分析（LFAs）中核酸直接检测人类粪便中大肠杆菌的示意图

纸基微流控器件

基于纸张的设备由于其简单、便携和快速检测的特性而获得了极大的关注。该平台因其价格合理、简单且具有成本效益的技术而得到迅速发展。这种器件是基于纸张多孔的毛细管作用，这使它们非常适合用作2D微流体纸基设备，并添加疏水屏障来创建通道。此外，将多个纸层堆叠到3D微流体纸基设备中可能与更先进的功能集成。

Teengam等科研人员使用蒽醌标记的吡咯烷基肽核酸诱导的银纳米粒子聚集，开发了一种用于同时检测中东呼吸综合征冠状病毒、结核分枝杆菌和人乳头瘤病毒寡核苷酸的纸基比色DNA传感器。他们将蜡图案打印到Whatman 1级滤纸中以创建通道，并基于包括两层纸的折纸平台制作传感器。

该传感器利用靶寡核苷酸与PNA探针功能化的金纳米粒子的特异性杂交以及AgNPs在靶寡核苷酸存在下的聚集。聚集导致肉眼可见的颜色变化，提供了一种简单且低成本的检测方法。

*用于中东呼吸综合征冠状病毒、结核分枝杆菌和人乳头瘤病毒寡核苷酸检测的纸基比色装置

纸基DNA传感器的另一种方法是使用电化学检测。电极通过各种技术在纸基板上制造，如丝网印刷法或喷墨印刷法。靶DNA将被固定在电极表面的探针捕获，导致电化学反应的变化，可以通过电化学技术测量。

Cinti等科研人员建立了一种纸基电化学生物传感器，用于使用丝网印刷碳电极检测单链和双链DNA。该传感器使用滤纸和复印纸作为基底，产生了易于图案化的表面，具有成本低和纳摩尔范围内核酸的高检测率。

*用于单链和双链DNA检测的电化学纸基平台制造方法示意图

DNA分析探针

影响DNA检测选择性的一个重要因素是探针的选择。探针是用于分析特定DNA序列的重要工具。根据沃森-克里克碱基配对规则，DNA检测的基本原理通常依赖于DNA/RNA靶标与其互补探针之间的特异性杂交。探针的设计对DNA传感器的有效性起着至关重要的作用，因为它必须能够以高准确性和特异性与所需的DNA序列杂交。

DNA探针的固定化是开发DNA生物传感器以选择性捕获其互补靶DNA的关键步骤。固定化程序的选择取决于基质的性质、探针和应用要求。此外，固定化程序应提供高反应性和可及性、良好的定向和较少的非特异性结合。

*DNA探针

作为最简单的方法，吸附被认为是固定DNA探针的直接策略之一。用于固定DNA生物传感器中的DNA探针的方法通常被称为物理吸附。通常，使用带正电的材料（如壳聚糖）或阳离子聚合物（如聚苯胺和聚吡咯）对基材进行改性。带有负电荷的DNA探针通过静电相互作用物理吸附在基底表面。值得注意的是，即使在底物上没有正电荷的情况下，由于范德华相互作用，DNA片段也表现出结合亲和力。当DNA和底物接近时，这些相互作用产生于瞬间的电子云极化，从而产生吸引力。

研究人员Teengam开发了一个基于吸附的DNA固定化的例子，制备了G-PANI修饰的电极。PANI结构上氨基的正电荷有利于通过静电相互作用固定带负电荷的探针。尽管该方法简单，但仍存在非特异性吸收和随机探针取向的问题，这可能会影响杂交效率和检测灵敏度。

*基于静电吸附的DNA探针

另一种有效的固定化策略是基于共价键。通常，DNA探针在3'或5'端用胺（Np）或硫醇（SH）修饰。这些官能团可以与底物表面的特定官能团共价结合。该方法表现出显著的优点，如高度特异性结合、优异的稳定性、灵活性和低非特异性吸附。各种共价反应已被广泛用于DNA探针的固定化。

Np封端的DNA探针通常用于固定含有羧基、醛基、环氧基和异硫氰酸酯基团的底物。碳二亚胺试剂经常用作该共价偶联反应中的交联剂。

*不同功能化基团修饰底物上的Np末端DNA探针

检测方法

实际上，人们已经开发出用于DNA检测的小型化平台来执行可访问的功能，例如多个步骤或自动化处理，以获得更好的性能，仍然需要适当的检测分析来与它们合作。

最近，几种分析方法已成功地用于基于微型化的DNA分析。其中比色法和电化学检测是最常见的检测技术。

比色法

比色检测以其简单、快速、经济的优点在DNA芯片上得到了广泛的应用。该方法包括在目标分析物存在的情况下观察颜色深度或颜色强度的变化，展示定性或定量信息。颜色变化可以用肉眼目视观察，也可以用分光光度计或色度计等仪器测量。基于几种传感原理，已经开发了大量的比色检测设备。

Tsai提出了一种使用AuNPs进行结核病诊断的纸基比色平台。该平台中DNA探针和TB靶DNA之间的杂交诱导了纳米颗粒表面电荷密度的变化，导致纳米颗粒的聚集。为了获得快速的现场分析，通过蜡印技术制造了纸基装置，以获得测试点。将样品溶液点在装置上，然后测量颜色强度。

*拟议的基于纸张的结核病检测设备示意图

另一个已经成功研发的引人注目的设计是折纸纸基分析设备（oPAD）。oPAD是通过折叠成所需的配置来制造的，该配置可能进行多个加载位点、多步骤和用于比色DNA分析的多重检测。该装置被制造成在单个装置内执行三个主要步骤：DNA纯化、DNA扩增和比色检测。oPAD分为两个主要部分。第一部分是分裂垫，第二部分由纯化/反应、染料和芯吸垫组成。这两个部件通过密封膜组装，以获得完整的oPAD。

操作时，将分离垫向纯化垫折叠，同时将芯吸垫折叠在其下方。将预处理过的样品加载到分离垫中，并流向涂有壳聚糖的纯化垫，用于纯化过程。之后，将纯化垫向装载LAMP试剂的反应垫折叠。然后将该装置加热至65°C持续30分钟，用于通过LAMP反应进行扩增步骤。LAMP产物包含在反应垫中。随后，加载漂白溶液，然后将染料垫折叠到反应垫上。最后，可以在视觉上观察到染料垫上的蓝色，对应于目标浓度。整个过程在1–2小时内成功运行。所提出的设备显示出简单、便携和可负担性，在医疗诊断和公共卫生领域具有潜在应用，特别是在低资源环境中。

*折纸纸基分析设备（oPAD）的组成和使用方法示意图

电化学检测法

电化学检测作为一种非常有前途的灵敏检测感兴趣DNA的方法，已经得到了广泛的认可。电化学DNA检测的传感原理主要取决于靶DNA与其互补探针之间的杂交，从而导致信号的变化，如电阻或电化学电流。

一种电化学DNA传感器传感策略通常基于标记系统。这种方法需要捕获探针或信号探针，用电活性分子或指示剂直接标记以产生可检测的信号。探针上标记的氧化还原分子和电极表面之间的变化距离在杂交时发生变化，导致电流响应发生变化。信号探针是指可以在三明治型平台或与靶DNA竞争性结合中使用的额外核酸序列。

Teengam等学者提出了一种用于检测HPV的纸基电化学DNA传感器。通过蜡印刷技术形成疏水屏障，然后使用丝网印刷方法在纸基材上制造电极。用G-PANI修饰工作电极，通过静电相互作用固定acpcPNA探针。在存在HPV靶DNA的情况下，由于PNA/DNA双链体的刚性，电化学信号与靶浓度成比例降低，从而提供了从AQ进行电子转移的不可接近性。

*在电极上修饰的石墨烯-聚苯胺复合物和固定化和杂交程序的示意图

然而，对感兴趣的DNA的电化学测量可能需要多个步骤，包括样品和试剂引入步骤、洗涤步骤和测量步骤，导致用户必须不可避免地以顺序方式或一步操作提供试剂/样品。出于这个原因，已经成功地建立了大量的几种DNA芯片设计来解决这些问题。在Srisomwat的工作中，弹出式折纸结构被设计为与HBV DNA的电化学检测相结合。

弹出装置的设计采用蜡染法在Whatman 1号滤纸基材上进行图案化。特征设计是试剂区和检测区的临时分离制造，这可以防止每个步骤中发生污染。在样品区，用于HBV的acpcPNA探针固定在样品区中，其中工作电极在装置的背面。将样品溶液添加到装置开放阶段的样品区，使探针和靶DNA完全杂交。

*弹出式DNA设备的示意图

电泳技术

电泳是一种用于根据蛋白质、抗体和核酸等生物分子的大小和电场下的电荷来分离和分析它们的技术。它优于其他检测方法，因为它能够将分子混合物分离成特定成分，从而进行更精确的识别。相反，电泳需要外部电源、长期操作和专业知识。

电泳通常使用支持介质，例如凝胶或非凝胶组合物来稳定载体电解质。然而，众所周知，这些传统的电泳方法体积大、价格昂贵且耗时，因此需要开发微芯片电泳技术，为POCT应用提供了快速性能、低样品和试剂消耗以及小型化尺寸等优势。

*微芯片电泳原理及其工作过程示意图

具有不同物理和化学性质的几种类型的纸基材被用于不同的应用。纤维素层析纸被用于在电泳技术中使用长双链RNA（dsRNA）作为病毒标记物的传染病快速筛查。这种方法利用微米和纳米级纤维素孔在纸张微流体通道中的外部电场下对不同尺寸的RNA进行分类。纸质CE芯片可以有效分离出浓度接近感染细胞的长dsRNA，为POCT水平的超快病毒疾病检测提供了一个新平台。

*用于电泳分离病毒长双链RNA的纸微流体芯片

未来展望

DNA是遗传信息的载体，为医学诊断相关问题提供答案。在成本效益高、操作简单和便携式诊断平台的愿景的驱动下，通过集成芯片上实验室技术，POCT在现代医疗系统中越来越突出。通过巧妙地设计微流体设备，从样品到结果的多个步骤，包括DNA提取、探针杂交和检测，现在可以在微型平台上操作。为了应对低成本、简单性和便携性的挑战，已经引入了几类微流体设备。提供无泵输送功能的微流体设备，如离心和毛细管驱动系统来驱动流体流动，已显示出在护理点条件下开发DNA芯片的巨大可持续性。

DNA芯片的令人兴奋的挑战是将其与强大的技术相结合，旨在实现有效的信号翻译和最低的检测极限。必须在保持良好的灵敏度和利用为未经培训的用户提供低成本、便携性和易于操作的检测技术之间找到平衡。光学检测和电化学技术有望在未来的DNA芯片研究中发挥重要作用。这些技术由于与手持设备的兼容性而特别有利。通过利用先进的光学技术和电化学信号放大，可以以高精度和高精度在低丰度水平下检测DNA靶点。随着分子诊断POCT的不断发展，下一代DNA芯片将有越来越多的研究工作将样品制备纳入芯片系统。