7分+的網路藥理學怎麽發？看幹濕結合如何助力網藥分析支棱起來！
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說到中藥，小夥伴們會不會想到神農嘗百草，為何要「嘗」，不過是想透過「濕實驗」研究其藥效。可如今除了「嘗」，研究中藥的方法自是多的很，而小雲首先想到的就是與生信這種「幹實驗」關聯密切的方法—利用網路藥理學進行研究。
要問小雲為啥會想到這個方法，那必然是想從實際出發，解決中醫藥領域朋友的發文問題,畢竟咱就說但凡和生信沾邊的是不是都哢哢容易出結果，哢哢容易發文章！其他領域早已經吃透了生信的紅利了，中藥領域也必須能！
所以小雲馬不停蹄的找到了一篇最新發表的利用網藥分析拿下7分+的文章和大家分享，看看人家是怎麽個思路。作者首先透過中藥與疾病的網路藥理分析構建疾病-靶標-活性成分網路，然後對關鍵靶蛋白和活性成分之間進行分子對接，最後再透過體外和體內實驗進行分析結果的驗證。看到這夥伴們是不是恍然大悟，沒錯，作者整體的思路便是幹濕結合，在常規的網藥分析的基礎上結合濕實驗使文章的品質和結果可信度都上了一個台階，與此同時再疊加分子對接、蛋白網路分析、深度機制探索這些亮點buff，不拿高分都難！所以小夥伴們看看，只要找對思路，幹濕實驗兩手抓，文章怎會不開花？
（ps：況且還有小雲幫你開大大的花，結大大的果子，感興趣的小夥伴可以來後台找小雲哦，無論是創新方向、研究思路還是解決辦法，小雲這應有盡有…）
研究背景
網路藥理學作為一種廣泛套用於中醫研究的工具，使人們能夠系統地評估藥物與疾病的關系，幫助研究人員發現新的藥物靶點和治療疾病的機制；冠狀動脈疾病(CAD)是一種由冠狀動脈內斑塊堆積引起的心血管疾病，動脈粥樣硬化(AS)是冠心病發生的重要病理基礎，而炎癥參與AS過程的所有階段；丹參(SM)是一種多年生草本植物，許多研究表明SM可以降低動脈粥樣硬化風險，但SM如何治療AS的分子機制並不清晰，因此在在本研究中，作者將網路藥理學與體外細胞和體內動物實驗相結合，闡明SM治療AS的分子機制。
數據來源
研究思路
作者從TCMSP和BATMAN-TCM資料庫獲得了104個SM活性成分和813個靶點，從GEO和GeneCards資料庫鑒定了35個SM與CAD之間的重疊靶點。利用這些數據構建了CAD-靶標-活性網路與關鍵活性成分-靶標-訊號通路網路，並利用35個重疊靶點進行GO、KEGG富集分析和PPI網路分析。隨後在核心活性成分丹參酮IIA（Tan IIA）與10個關鍵靶蛋白之間進行了分子對接模擬，分析了分子與蛋白的交互作用。最後在AS小鼠模型和HUVECs上驗證了SM的治療作用和靶點機制。
主要結果
1. CAD-靶標-活性成分網路的構建
作者從TCMSP和BATMAN-TCM資料庫中篩選SM候選成分，在TCMSP中共獲得65個SM候選成分和78個靶點，BATMAN-TCM中共獲得39個SM候選成分和770個靶點，去重後共鑒定出96個SM候選成分和813個靶點。並從GES66360數據集中篩選出CAD組和正常組之間的632個DEGs。生成了火山圖和熱圖來視覺化DEGs(圖1A,B)。而後透過GeneCards資料庫最終確定了218個CAD靶點(圖1C)。在SM的813個靶點和CAD的218個靶點中，確定了35個重疊靶點(圖1C)，表明這些共同靶點可能對SM治療CAD至關重要。為了闡明SM在治療CAD中的作用，作者利用剔除了非活性成分，利用61種化合物構建了CAD-靶標-活性成分網路(圖1D)。該網路由97個節點組成，其中1個疾病節點，61個SM有效成分，35個靶點。
圖1 CAD-靶標-活性成分網路
2. GO和KEGG富集分析
作者對35個靶基因進行了GO和KEGG富集分析，以闡明這些基因參與CAD發病機制的潛在機制。共鑒定了211個GO條目，包括168個生物過程(BP)、18個細胞成分(CC)和25個分子功能(MF)。35個靶基因主要參與炎癥反應和訊息傳遞的生物學過程。圖2A顯示了前10個GO條目的富集分析。此外對35個靶基因進行了KEGG富集分析，鑒定出43個訊號通路。除了與其他疾病相關的通路外，TNF訊號通路等是富集程度最高的通路(圖2B)。基於這些分析，SM可能透過調節與炎癥有關的訊號通路來治療CAD。
3. 關鍵活性成分-靶標-通路網路構建及PPI網路分析
作者利用Cytoscape3.7.2構建了一個活性成分-靶標-通路網路(圖2C)。節點的大小表示其環通度的程度，節點越大代表關系越廣泛。該網路由37個節點組成，包括10個關鍵活性成分、17個靶基因、10個主要訊號通路和106個邊緣。Tan IIA被確定為SM治療CAD的主要有效成分，TNF和PTGS2是其主要靶點。此外，作者利用STRING資料庫構建了一個蛋白質-蛋白質交互作用(PPI)網路，該網路包括35個節點和155個交互作用(圖2D)。並篩選了20種連線程度最高的蛋白，結果表明TNF與其他25種蛋白交互作用，表明它在CAD中起著至關重要的作用(圖2E)。此外，作者還使用Cytohubba的MCC演算法分析了前10個交互作用蛋白(圖2F)。
圖2 關鍵活性成分-靶標-通路網路構建及PPI網路分析
4. Tan IIA與關鍵蛋白靶點的對接模擬
Tan IIA是SM的主要脂溶性成分，大量研究表明其在治療心血管疾病中具有關鍵作用。為了證實其與10個交互作用最多的蛋白靶點的交互作用，作者進行了分子對接模擬。研究結果表明，TNF與Tan IIA的結合最穩定，其次是PTGS2、ICAM1和MMP9。此外，所有10個蛋白靶點的對接結合能都低於-5.0 kcal⋅mol–1，表明Tan IIA可能是這些蛋白靶點的拮抗劑，這些蛋白靶點與CAD的進展有關。圖3以四個蛋白靶點與Tan IIA的結合位點和氫鍵為例進行展示。
圖3 Tan IIA分別與PTGS2、ICAM1、MMP9、TNF的結合位點和氫鍵
5.丹參、Tan IIA均有抗動脈粥樣硬化的作用
AS被認為是CAD的病理基礎。飼餵高脂肪致動脈粥樣硬化飲食的ApoE-/-小鼠是研究動脈粥樣硬化和早期慢性CAD的成熟模型。因此作者利用ApoE-/-小鼠，透過研究SM和Tan IIA的治療作用，驗證網路藥理學和分子對接的研究結果。如圖4A和4C所示，SM和Tan IIA均能減輕ApoE-/-小鼠的主動脈粥樣硬化和斑塊面積。主動脈根部的染色也表明，SM和Tan IIA均能減少脂質積累，減輕血管壁損傷，減少斑塊大小。此外，Tan IIA促進了主動脈根部膠原的積累(圖4B, 4D-4G)。這些數據表明，SM和Tan IIA都能減輕ApoE-/-小鼠的斑塊面積和脂質積累，顯示出明顯的抗動脈粥樣硬化治療作用。
圖4 SM和Tan IIA具有抗動脈粥樣硬化的作用
6.丹參和Tan IIA可降低ApoE-/-小鼠血管炎性因子的表達
KEGG分析結果顯示，TNF訊號通路和NF-κB訊號通路是SM和Tan IIA抗動脈粥樣硬化作用的主要機制。如圖5A-5D所示，SM和Tan IIA可降低ApoE-/-小鼠主動脈中TNF-α和NF-κ b的表達。此外，SM和Tan IIA也降低了ICAM1和MMP9的表達水平。表明SM和Tan IIA降低了ApoE-/-小鼠血管炎癥因子的表達。分子對接模擬結果顯示，COX-2 (PTGS2)參與了SM和Tan IIA的抗炎作用。以上數據顯示ApoE-/-小鼠主動脈COX-2表達升高，而SM和Tan IIA降低了ApoE-/-小鼠主動脈COX-2表達(圖5E和5F)。且SM和Tan IIA透過抑制COX-2、TNF-α和NF-κ b的表達在降低血管炎癥反應中發揮了關鍵作用。
圖5 SM和Tan IIA降低ApoE-/-小鼠血管炎癥因子的表達
7. Tan IIA透過抑制COX-2表達，降低炎癥因子的表達，挽救ox-LDL誘導的HUVECs功能障礙
由於Tan IIA與SM具有相似的抗動脈粥樣硬化和抗炎作用，作者使用Tan IIA進一步研究SM在體外抗炎作用中的作用機制。最初，透過增殖檢測實驗確定Tan IIA幹預人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的最佳濃度為25 μg/mL(圖6A)。細胞免疫熒光染色顯示，ox-LDL培養的HUVECs中COX-2、TNF-α和NF-κB的表達水平高於正常HUVECs，但在細胞中添加Tan IIA後，這種上調表達被抑制(圖6B-6D)。此外，在ox-LDL誘導的HUVECs中，Tan IIA阻止NF-κB p65進入細胞核(圖6C)。Western blotting實驗證實了這些結果。如圖6E - 6F所示，Tan IIA降低了ox-LDL誘導的炎癥因子的上調表達。
圖6 Tan IIA可降低HUVECs中炎癥因子的表達
Tan IIA還挽救了ox- LDL引起的細胞遷移和管形成的減少，透過轉染COX-2過表達質體逆轉了這一現象(圖7A-7E)。Tan IIA降低了ox-LDL培養的HUVECs中NF-κB、TNF-α、ICAM1和MMP9的表達，在添加COX-2過表達質體後，這種作用被逆轉(圖7F - 7G)。這些數據表明，Tan IIA抑制COX-2的表達，降低炎癥因子的表達，保護細胞免受ox-LDL損傷。
圖7 Tan IIA透過抑制COX-2表達，降低炎癥因子表達，挽救ox-LDL誘導的HUVECs功能障礙
文章小結
該文章針對中藥丹參和AS進行了網路藥理學分析，並結合細胞實驗和動物實驗來提升分析結果的說服力，中間更是利用分子對接、各種網路構建來提加文章的創新性，所以對網路藥理學分析感興趣的小夥伴們還在等什麽，趕緊碼住這個思路，高分文章就在前面等你，沖就完了！
如果你還苦惱於生信分析沒有思路，或者嫌分析方法太過簡單、太過老套，想要創新思路，需要復現或了解更多分析思路的朋友歡迎call小雲，風裏雨裏小雲等你！
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