第1階段 冷凍
為了在載玻片上準備組織切片，我們必須先冷凍樣品，然後進行切片和固定。
所需材料
-樣品
-異戊烷
-幹冰
-OCT化合物
-組織包埋模具和包埋盒
實驗步驟
1.準備冷異戊烷浴。
1.1將幹冰裝入一個大的絕緣容器中。
1.2用異戊烷填充金屬容器並將容器置於幹冰上。
1.3等待5分鐘，讓異戊烷被幹冰冷卻。
提示：幹冰和異戊烷的含量應相同。
異戊烷可能會在容器邊緣或底部凍結；不要讓異戊烷完全凍結。
2 .將新鮮組織放入包埋模具中，並用OCT化合物填充。同時根據需要調整組織的方向。
3 .使用異戊烷浴冷凍組織。
3.1用鑷子將組織模型放在異戊烷浴上10 - 20秒，直到組織塊變得不透明。
註意：避免讓任何異戊烷接觸到OCT化合物。
4.將冷凍組織儲存在-80°C下直至準備切片。
第 2 階段 切片
一旦組織被嵌入，我們就可以將其切成薄片並將其安裝到顯微鏡載玻片上。
所需材料
-冷凍組織樣本
-合適的載玻片
-低溫恒溫器
-低溫恒溫器刀片
實驗步驟
1.將冷凍的組織樣本放入低溫恒溫器中，降至-20°C，過夜。
註意：確保所有使用的工具在切割前都保存在低溫恒溫器中並降低至同一溫度。
2.將冷凍塊安裝到樣品架上。
3.將低溫恒溫器刀片放入支架中，確保其固定，並按照儀器說明來設定間隙角。
註意：應調整刀片間隙角以實作最佳效能。
4.修剪冷凍組織塊，露出組織表面。修整厚度通常為10-30 µm。
5.繼續切割厚度為5 - 8 µm的切片。
提示：剛開始切出來的切片可能包含因修剪而造成的孔洞，無法用於後續實驗。
6.用刷子收集切片並將其放在載玻片上，以備後續固定步驟。
提示：也可以使用牙簽，或者可以稍微擡起切片，並將載玻片正對著切片放置，切皮隨後會粘附在載玻片上，註意避免讓切片與載玻片邊緣接觸。
第 3 階段 固定
這裏我們需要風幹冷凍樣本，然後進行固定，以在抗體孵育之前保存蛋白質和組織形態。
所需材料
-合適的組織切片
-洗滌緩沖液（PBST）
-固定劑（10% NBF 或4% PFA、100%丙酮或甲醇）
實驗步驟
1.將冷凍樣品在室溫下幹燥15分鐘。
提示：該過程在冷凍、包埋和冷凍樣本切片後開始。這與石蠟包埋不同，石蠟包埋是在包埋之前進行固定。
2 .選擇合適的室溫固定劑。
表 1. IHC中常用的固定劑。
註意： 對於新抗體，我們建議從三個方面入手：
1）4%多聚甲醛
2）100%甲醇
3）丙酮：酒精（甲醇或乙醇）1:1溶液
請註意，10％NBF和4％PFA中的甲醛濃度幾乎相同。
3.將組織載玻片浸入固定液中，在室溫下孵育樣品15分鐘。
4.用PBST清洗組織載玻片三次。
註意：對於丙酮固定，在氣流下風幹30分鐘，使其完全幹燥。
第 4 階段 封閉
在IHC中，封閉步驟對於防止影像中的高背景染色尤為重要。
所需材料
-固定好的組織切片
-蛋白質封閉液（例如：2-10%跟二抗為同物種的正常血清，或無血清蛋白塊）
-生物素封閉溶液（可選-用於生物素化抗體）
-內源性過氧化物酶封閉液（可選）
-洗滌緩沖液，PBST（PBS, 0.05% Triton X-100）
實驗步驟
1.用PBST清洗載玻片兩次，每次5分鐘。
2.進行內源性親和素/生物素封閉（可選）。
2.1室溫下將載玻片放入親和素封閉溶液中孵育10分鐘。
2.2用PBST清洗載玻片一次。
2.3室溫下將載玻片放入生物素封閉溶液中孵育10分鐘。
2.4用PBST清洗載玻片一次。
註意： 您應該僅對生物素化抗體執行此步驟。
3 .執行內源過氧化物酶封閉（可選）。
3.1將載玻片與3%過氧化氫在室溫下孵育10分鐘。
3.2用PBST清洗載玻片一次。
註意： 您應該僅對過氧化物酶偶聯的抗體執行此步驟。
4 .執行蛋白質封閉。
4.1將載玻片在蛋白質封閉試劑中室溫孵育30 - 60分鐘。
註意：您應該對所有IHC實驗執行此步驟。
如果使用血清進行封閉，則血清應與二抗的宿主物種相匹配。
封閉溶液不應含有一抗宿主動物血清，否則可能會導致高背景。
5.用PBST清洗載玻片三次，每次5分鐘。
6.進行免疫染色。
第 5 階段 抗體孵育
完成必要的封閉步驟後，我們就可以開始用抗體染色組織了。我們可以使用偶聯的一抗直接染色組織，也可以使用偶聯的二抗間接染色組織。
多色IHC涉及用兩種或多種抗體對細胞進行染色，以顯示兩種或多種目標蛋白的分布。下面給出的間接和直接方案均適用於多色IHC。我們可以同時用多種抗體組孵育細胞，也可以按順序用每種抗體組孵育細胞，並在每次孵育之間進行封閉。
【直接染色法】
所需材料
-已進行相關封閉步驟的組織
-抗體稀釋緩沖液（PBS + 1％BSA）
-洗滌緩沖液（PBST）
-偶聯一抗
實驗步驟
1.確定要使用的最佳抗體稀釋度，然後用含有1% BSA的PBS稀釋抗體。
註意：抗體數據表上通常會建議最佳稀釋度。
如果沒有，您可能需要進行稀釋以找到最佳的抗體濃度。
2.將載玻片放入預先稀釋的一抗中孵育 室溫下1小時，或在4°C下過夜。
註意：孵化時間可能需要最佳化。
抗體溶液需要完全覆蓋樣本。
使用疏水屏障筆可以幫助容納少量液體。
3.用PBST清洗載玻片三次。
4.繼續進行復染、封片和成像。
【間接染色法】
所需材料
-已進行相關封閉步驟的組織
-稀釋緩沖液（PBS，1％BSA）
-洗滌緩沖液 （PBST）
-一抗
-偶聯二抗
-疏水屏障筆-可選
實驗步驟
1.用含有1% BSA的PBS稀釋一抗和二抗。
註意：抗體數據表上通常會建議稀釋度。
您可能需要進行稀釋以找到最佳的抗體濃度。
2.將樣本與預先稀釋的一抗一起孵育，室溫下1 - 2小時，或在4℃下過夜。
註意：孵化時間可能需要最佳化。
3 .用PBST清洗載玻片3次。
4 .根據制造商的指導，用預稀釋的二抗孵育樣品。通常，建議在室溫下孵育45-60 分鐘。
註意：孵化時間可能需要最佳化。
如果使用熒光團，則必須在黑暗中孵育以避免光漂白。
在添加HRP標記的二抗之前，此時可以進行內源過氧化物酶封閉。
5 .用PBST清洗載玻片3次。
6 .有需要的話繼續復染、封固和成像。
第六階段 檢測
用抗體孵育後，您現在可以根據以下步驟對載玻片進行成像。
【比色法】
所需材料
-用酶聯抗體染色的組織玻片
-顯色受質（HRP 範例：DAB D573235、 AEC A383182）
-復染（可選，例如：Mayer's蘇木精H301933）
-安裝介質
-密封劑（水性封固劑可選，例如指甲油或檸檬烯）
-蓋玻片
-顯微鏡
實驗步驟
1.將載玻片浸入顯色受質溶液中。孵育直至觀察到所需顏色。
註意：在孵育過程中要目視監測染色情況。
如果需要的話，可以在這裏添加AP封閉。
2.用冷流水沖洗載玻片以除去多余的受質。
3.將載玻片浸入復染溶液中（可選）。
3.1按照制造商的指導在室溫下進行孵育，或直到觀察到所需顏色。
4.用冷流水沖洗載玻片，以除去多余的染色劑並使蘇木精變藍。
5.在使用有機封固劑之前，對組織進行脫水和清潔（可選） 。
5.1在室溫下，在 Coplin 罐中手動或在自動嵌入系統中進行以下交換。
6.在載玻片上加入幾滴封片劑：讓載玻片在室溫下靜置5分鐘。
註意：使用覆蓋載玻片所需的最小體積。
7.使用鑷子小心地將蓋玻片放在載玻片上。
-如果使用水性封固劑，請用檸檬烯或指甲油密封蓋玻片。
-如果使用有機封固劑，請讓封固劑完全幹燥。
註意：小心不要引入任何氣泡或擾亂樣品。
8.使用顯微鏡對載玻片進行成像。
註意：如果不立即使用，請將載玻片存放在4°C下。
【熒光法】
所需材料
-用熒光團偶聯抗體染色的組織切片
-熒光復染劑（可選，例如： DAPI D106471 ）
-適用於熒光檢測的封固劑（例如 F598330 ）
-密封劑（例如M292692 , A598329 ）
-蓋玻片
-顯微鏡
-去離子（DI）水
實驗步驟
1.將載玻片浸入復染液中 按照制造商的指導在室溫下進行或直到觀察到所需的顏色（可選） 。
註意：一些封片劑添加了熒光復染劑，從而無需額外的復染步驟。
2.用冷去離子水清洗載玻片以去除多余的汙漬。
3.在載玻片上滴幾滴封片劑。然後讓載玻片在室溫下靜置約5分鐘。
註意：使用封固切片所需的最小體積。
4.使用鑷子小心地將蓋玻片放在載玻片上。如果使用水性封固劑，請用檸檬烯或指甲油密封蓋玻片。
5.使用顯微鏡對載玻片進行成像。
註意：如果不立即使用，請將載玻片存放在4°C的黑暗環境中。
