引言
在传统观点中，结肠癌起源于干细胞。然而，炎症是结肠癌的主要风险因素之一，它能够抑制肠道干细胞的特性。 6月20日 Nature Genetics 报道的研究」 Non-stem cell lineages as an alternative origin of intestinal tumorigenesis in the context of inflammation 「 ，以帕内斯细胞(Paneth cells)为模型， 评估在炎症背景下，已分化的细胞谱系是否能触发小鼠肠道肿瘤的形成 。在炎症的作用下，帕内斯细胞中Apc基因的特异性突变导致了类似于炎症性肠病患者及较大部分人类散发性结肠癌的肠道肿瘤。这可能是由于西方饮食习惯引发的炎症反应，而这种饮食习惯是结肠癌的一个主要风险因素。利用旨在预测癌症起源细胞的机器学习方法，研究人员发现， 在相当一部分散发性结肠癌病例中，其起源细胞并非干细胞，而是分泌细胞谱系 。
大多数癌症被认为起源于具有干细胞或祖细胞特性的细胞，这些细胞具备活跃增殖、自我更新和分化的能力。 这一点在小鼠肠道中得到了证明，当Apc肿瘤抑制基因的功能丧失突变发生在Lgr5+肠道干细胞时，成功引发了腺瘤的形成。然而，当相同的Apc突变引入到更成熟、寿命更短的转运放大细胞中时，肿瘤的形成在早期微腺瘤阶段被阻止。然而， 除了这种「自上而下」的模式，肠道肿瘤发生的「自下而上」模型也被提出，在这种模型中，位于隐窝-绒毛轴较高位置的更成熟的肠道细胞在组织损伤和炎症的背景下可能会启动癌症 。西方饮食习惯和慢性炎症是与消化道散发性恶性疾病风险增加相关的两大主要病因因素，被认为会引发肠道上皮中的特定细胞和分子改变，最终导致肿瘤发生和进展目标细胞的扩展。
帕内斯细胞是位于小肠隐窝底部的特化分泌细胞，能够向肠腔分泌抗菌肽。此外，它们还提供必要的物理支持，并分泌信号以维持Lgr5+干细胞的功能。 在结肠中，虽然没有帕内斯细胞，但Kit+帕内斯样细胞（也称为深隐窝分泌细胞）在功能上与小肠中的帕内斯细胞类似，也扮演分泌和微环境支持的角色。在该研究中，研究人员利用帕内斯细胞作为模型，证明其在炎症背景下具有去分化和肿瘤形成的能力。
研究结果显示， 在炎症背景下，帕内斯细胞可以通过Apc基因的失活突变引发肠道腺瘤的形成。当Apc突变与Kras或Trp53基因突变结合时，即使没有炎症刺激，也会显著增加帕内斯细胞衍生肿瘤的数量并加速其向恶性表型的转化。 进一步的分子标记分析表明，帕内斯细胞衍生的肿瘤与Lgr5+干细胞衍生的肿瘤在组织学和基因表达模式上存在显著差异，反映了其在肿瘤发生过程中不同的细胞命运和信号通路的激活。
综上所述， 该研究揭示了肠道肿瘤发生的另一条「自下而上」的途径，即帕内斯细胞在炎症背景下能够去分化并形成肿瘤 。这一发现对于理解炎症性肠病相关癌症以及饮食引发的结肠癌具有重要意义，并可能为新的治疗策略提供依据。
结肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球范围内发病率和致死率均居高不下的恶性肿瘤类型之一。传统上，研究认为CRC的起源主要与干细胞相关。然而，越来越多的证据表明，炎症在结肠癌的发生和发展中扮演着重要角色。炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）患者的结肠癌风险显著增加，这提示炎症可能通过影响肠道上皮细胞的功能和特性，诱导肿瘤形成 。
该研究通过以下几种主要方法来探讨帕内斯细胞在肠道肿瘤形成中的作用：
基因操作： 使用Cre-loxP系统特异性地在帕内斯细胞中引入Apc、Kras和Trp53基因突变。具体而言，通过将含有这些基因突变的loxP小鼠与表达帕内斯细胞特异性Cre重组酶的Lyz1-CreERT2小鼠进行杂交，生成携带特定基因突变的帕内斯细胞。这些基因突变已知在结肠癌的发生中起关键作用。
炎症诱导： 采用二硝基硫酸钠（Dextran Sodium Sulfate, DSS）诱导小鼠肠道炎症。DSS通过饮水方式给予小鼠，能够引发类似于人类炎症性肠病的肠道炎症反应。研究中，DSS溶液浓度为2%，持续时间根据实验设计而定。
对从小鼠肠道上皮细胞中分离的单个细胞进行RNA测序，分析不同基因突变和炎症条件下的细胞转录组变化。通过使用10x Genomics平台，研究人员能够获得高分辨率的单细胞转录组数据。 通过qPCR技术检测肿瘤组织中特定基因的表达水平，如Lyz1和Dclk1。 使用抗体标记技术对肿瘤组织切片进行染色，观察特定蛋白质的表达和分布。 研究中使用了抗β-连环蛋白（β-catenin）、LYZ1和DCLK1抗体，以评估肿瘤细胞的标志物表达情况。
帕内斯细胞的去分化和肿瘤形成
在炎症背景下（DSS处理），帕内斯细胞中Apc基因突变能够引发肠道腺瘤形成。数据表明，在给予DSS的条件下，Apc突变小鼠的肠道腺瘤发生率显著增加（p < 0.001）。
当Apc突变与Kras或Trp53基因突变结合时，即使没有DSS诱导的炎症，这些小鼠仍表现出显著的肿瘤形成。数据表明，帕内斯细胞中Apc和Kras双突变的小鼠肿瘤发生率增加了6.1倍，而Apc和Trp53双突变的小鼠肿瘤发生率增加了1.6倍（均无DSS处理）。
转录组分析
单细胞RNA测序结果显示，在帕内斯细胞中引入Apc突变并施加DSS诱导的炎症条件下，帕内斯细胞表现出特异性的转录组变化，标志着其去分化为肿瘤起源细胞。帕内斯细胞中与干细胞相关的基因（如Cd81和Prom1）的表达显著上调，而与分化相关的基因（如Lyz1）的表达显著下调。
qPCR数据支持这一发现，显示在帕内斯细胞衍生的肿瘤中，Lyz1表达水平较低（p = 7.5 × 10^-4），而Dclk1表达水平较高（p < 0.001）。
免疫组化验证
免疫组化分析显示，帕内斯细胞衍生的肿瘤中，β-连环蛋白（β-catenin）的核和细胞质积聚显著增加，这与肿瘤细胞的去分化和增殖有关。
LYZ1和DCLK1的免疫染色结果表明，在帕内斯细胞衍生的肿瘤中，LYZ1阳性细胞比例较低，而DCLK1阳性细胞比例较高。这一结果与qPCR数据一致，进一步验证了帕内斯细胞在特定条件下的去分化能力。
炎症激活了结肠中不同的肿瘤起源细胞（cells-of-origin） （Credit: Nature Medicine ）
a. 未处理的小鼠、给予3% DSS处理7天的小鼠，以及分别喂养AIN-76A或NWD1合成饮食3个月的小鼠。 分析这些小鼠的结肠组织中增殖性深隐窝分泌细胞（DCS cells）的存在。 使用WGA染色标记DCS细胞，用Ki67标记增殖细胞，DAPI对细胞核进行对比染色。 图中星号标记的是WGA和Ki67双阳性细胞。
b. WGA+Ki67+ 细胞的量化：在图a中，通过统计下结肠隐窝底部的WGA和Ki67双阳性细胞的数量，显示了DSS处理和不同饮食对DCS细胞增殖的影响。
c. WGA+ 细胞的总量化：统计下结肠隐窝底部的WGA阳性细胞总数。
d. 预测肿瘤起源细胞： 使用COOBoostR计算方法预测IBD相关结肠癌（IBD-CRC, n=25）和散发性结肠癌（sCRC, n=257）的肿瘤起源细胞。 条形图显示了不同起源细胞在IBD-CRC和sCRC中的分布。
e. 免疫组化分析： 健康对照和IBD患者的结肠组织， 使用MUC2、BEST4和Ki67进行免疫组化分析，星号标记双阳性细胞。
f. 增殖细胞的百分比： 溃疡性结肠炎（UC）患者和健康对照， 显示增殖（Ki67+）的MUC2+和REG4+细胞在UC患者和健康对照中的百分比。 数据来自12名健康参与者和17名UC患者。
g. 干细胞指数： IBD-CRC和sCRC亚组中具有RNA测序数据的病例（n=27干细胞，n=10杯状细胞）。
h. CMS映射： 根据预测的肿瘤起源细胞分层的肿瘤样本。 图显示了CMS（共识分子亚型）在不同肿瘤起源细胞中的分布，P值为Fisher精确检验结果。
研究得出的模型显示结肠癌可以从干细胞（ISC）或分化细胞起源，后者在炎症刺激下被激活。再生性干细胞（RSC）重新编程在支持再生反应中被激活。在这个过程中，活跃分裂的RSC扩大了肿瘤启动和进展的细胞目标，导致一种以炎症表型为特征的肿瘤发生替代途径。
近年来，针对肿瘤起源细胞的研究不断深入，揭示了不同类型细胞在肿瘤发生中的潜在贡献。例如， 有研究发现，胃肠道中的特定细胞类型在特定病理条件下能够去分化并获得干细胞特性，从而成为肿瘤的起源细胞。这一发现不仅挑战了传统的肿瘤起源理论，也为肿瘤预防和治疗提供了新的思路。
此外，随着单细胞测序技术的发展，研究人员能够更精确地解析肿瘤微环境中不同细胞类型的作用和相互关系。例如，该研究通过单细胞RNA测序揭示了帕内斯细胞在炎症背景下的转录组变化，提供了新的视角来理解炎症性肠病相关癌症的发生机制。
该研究通过小鼠模型和基因操作技术，揭示了帕内斯细胞在结肠癌发生中的关键作用。这一发现不仅为理解结肠癌的发生机制提供了新的视角，也为未来的癌症预防和治疗策略提供了新的靶点。特别是针对炎症性肠病患者的结肠癌预防和治疗，该研究的结果具有重要的临床意义。
综上所述，该研究通过多种实验手段和先进技术，揭示了帕内斯细胞在特定病理条件下的去分化和肿瘤形成能力。 这一发现不仅拓展了我们对结肠癌发生机制的理解，也为未来的研究和治疗提供了重要的参考。随着技术的发展和研究的深入，有望进一步揭示肿瘤起源细胞的多样性和复杂性，为肿瘤防治开辟新的道路。
参考文献
Verhagen MP, Joosten R, Schmitt M, Välimäki N, Sacchetti A, Rajamäki K, Choi J, Procopio P, Silva S, van der Steen B, van den Bosch TPP, Seinstra D, de Vries AC, Doukas M, Augenlicht LH, Aaltonen LA, Fodde R. Non-stem cell lineages as an alternative origin of intestinal tumorigenesis in the context of inflammation. Nat Genet. 2024 Jun 20. doi: 10.1038/s41588-024-01801-y. Epub ahead of print. PMID: 38902475.
https://www.nature.com/articles/s41588-024-01801-y
责编 |探索君
排版|探索君
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