7分+的网络药理学怎么发？看干湿结合如何助力网药分析支棱起来！
欢迎点赞+收藏+关注[给你小心心]
说到中药，小伙伴们会不会想到神农尝百草，为何要「尝」，不过是想通过「湿实验」研究其药效。可如今除了「尝」，研究中药的方法自是多的很，而小云首先想到的就是与生信这种「干实验」关联密切的方法—利用网络药理学进行研究。
要问小云为啥会想到这个方法，那必然是想从实际出发，解决中医药领域朋友的发文问题,毕竟咱就说但凡和生信沾边的是不是都咔咔容易出结果，咔咔容易发文章！其他领域早已经吃透了生信的红利了，中药领域也必须能！
所以小云马不停蹄的找到了一篇最新发表的利用网药分析拿下7分+的文章和大家分享，看看人家是怎么个思路。作者首先通过中药与疾病的网络药理分析构建疾病-靶标-活性成分网络，然后对关键靶蛋白和活性成分之间进行分子对接，最后再通过体外和体内实验进行分析结果的验证。看到这伙伴们是不是恍然大悟，没错，作者整体的思路便是干湿结合，在常规的网药分析的基础上结合湿实验使文章的质量和结果可信度都上了一个台阶，与此同时再叠加分子对接、蛋白网络分析、深度机制探索这些亮点buff，不拿高分都难！所以小伙伴们看看，只要找对思路，干湿实验两手抓，文章怎会不开花？
（ps：况且还有小云帮你开大大的花，结大大的果子，感兴趣的小伙伴可以来后台找小云哦，无论是创新方向、研究思路还是解决办法，小云这应有尽有…）
研究背景
网络药理学作为一种广泛应用于中医研究的工具，使人们能够系统地评估药物与疾病的关系，帮助研究人员发现新的药物靶点和治疗疾病的机制；冠状动脉疾病(CAD)是一种由冠状动脉内斑块堆积引起的心血管疾病，动脉粥样硬化(AS)是冠心病发生的重要病理基础，而炎症参与AS过程的所有阶段；丹参(SM)是一种多年生草本植物，许多研究表明SM可以降低动脉粥样硬化风险，但SM如何治疗AS的分子机制并不清晰，因此在在本研究中，作者将网络药理学与体外细胞和体内动物实验相结合，阐明SM治疗AS的分子机制。
数据来源
研究思路
作者从TCMSP和BATMAN-TCM数据库获得了104个SM活性成分和813个靶点，从GEO和GeneCards数据库鉴定了35个SM与CAD之间的重叠靶点。利用这些数据构建了CAD-靶标-活性网络与关键活性成分-靶标-信号通路网络，并利用35个重叠靶点进行GO、KEGG富集分析和PPI网络分析。随后在核心活性成分丹参酮IIA（Tan IIA）与10个关键靶蛋白之间进行了分子对接模拟，分析了分子与蛋白的相互作用。最后在AS小鼠模型和HUVECs上验证了SM的治疗作用和靶点机制。
主要结果
1. CAD-靶标-活性成分网络的构建
作者从TCMSP和BATMAN-TCM数据库中筛选SM候选成分，在TCMSP中共获得65个SM候选成分和78个靶点，BATMAN-TCM中共获得39个SM候选成分和770个靶点，去重后共鉴定出96个SM候选成分和813个靶点。并从GES66360数据集中筛选出CAD组和正常组之间的632个DEGs。生成了火山图和热图来可视化DEGs(图1A,B)。而后通过GeneCards数据库最终确定了218个CAD靶点(图1C)。在SM的813个靶点和CAD的218个靶点中，确定了35个重叠靶点(图1C)，表明这些共同靶点可能对SM治疗CAD至关重要。为了阐明SM在治疗CAD中的作用，作者利用剔除了非活性成分，利用61种化合物构建了CAD-靶标-活性成分网络(图1D)。该网络由97个节点组成，其中1个疾病节点，61个SM有效成分，35个靶点。
图1 CAD-靶标-活性成分网络
2. GO和KEGG富集分析
作者对35个靶基因进行了GO和KEGG富集分析，以阐明这些基因参与CAD发病机制的潜在机制。共鉴定了211个GO条目，包括168个生物过程(BP)、18个细胞成分(CC)和25个分子功能(MF)。35个靶基因主要参与炎症反应和信号转导的生物学过程。图2A显示了前10个GO条目的富集分析。此外对35个靶基因进行了KEGG富集分析，鉴定出43个信号通路。除了与其他疾病相关的通路外，TNF信号通路等是富集程度最高的通路(图2B)。基于这些分析，SM可能通过调节与炎症有关的信号通路来治疗CAD。
3. 关键活性成分-靶标-通路网络构建及PPI网络分析
作者利用Cytoscape3.7.2构建了一个活性成分-靶标-通路网络(图2C)。节点的大小表示其连通性的程度，节点越大代表关系越广泛。该网络由37个节点组成，包括10个关键活性成分、17个靶基因、10个主要信号通路和106个边缘。Tan IIA被确定为SM治疗CAD的主要有效成分，TNF和PTGS2是其主要靶点。此外，作者利用STRING数据库构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，该网络包括35个节点和155个相互作用(图2D)。并筛选了20种连接程度最高的蛋白，结果表明TNF与其他25种蛋白相互作用，表明它在CAD中起着至关重要的作用(图2E)。此外，作者还使用Cytohubba的MCC算法分析了前10个相互作用蛋白(图2F)。
图2 关键活性成分-靶标-通路网络构建及PPI网络分析
4. Tan IIA与关键蛋白靶点的对接模拟
Tan IIA是SM的主要脂溶性成分，大量研究表明其在治疗心血管疾病中具有关键作用。为了证实其与10个相互作用最多的蛋白靶点的相互作用，作者进行了分子对接模拟。研究结果表明，TNF与Tan IIA的结合最稳定，其次是PTGS2、ICAM1和MMP9。此外，所有10个蛋白靶点的对接结合能都低于-5.0 kcal⋅mol–1，表明Tan IIA可能是这些蛋白靶点的拮抗剂，这些蛋白靶点与CAD的进展有关。图3以四个蛋白靶点与Tan IIA的结合位点和氢键为例进行展示。
图3 Tan IIA分别与PTGS2、ICAM1、MMP9、TNF的结合位点和氢键
5.丹参、Tan IIA均有抗动脉粥样硬化的作用
AS被认为是CAD的病理基础。饲喂高脂肪致动脉粥样硬化饮食的ApoE-/-小鼠是研究动脉粥样硬化和早期慢性CAD的成熟模型。因此作者利用ApoE-/-小鼠，通过研究SM和Tan IIA的治疗作用，验证网络药理学和分子对接的研究结果。如图4A和4C所示，SM和Tan IIA均能减轻ApoE-/-小鼠的主动脉粥样硬化和斑块面积。主动脉根部的染色也表明，SM和Tan IIA均能减少脂质积累，减轻血管壁损伤，减少斑块大小。此外，Tan IIA促进了主动脉根部胶原的积累(图4B, 4D-4G)。这些数据表明，SM和Tan IIA都能减轻ApoE-/-小鼠的斑块面积和脂质积累，显示出明显的抗动脉粥样硬化治疗作用。
图4 SM和Tan IIA具有抗动脉粥样硬化的作用
6.丹参和Tan IIA可降低ApoE-/-小鼠血管炎性因子的表达
KEGG分析结果显示，TNF信号通路和NF-κB信号通路是SM和Tan IIA抗动脉粥样硬化作用的主要机制。如图5A-5D所示，SM和Tan IIA可降低ApoE-/-小鼠主动脉中TNF-α和NF-κ b的表达。此外，SM和Tan IIA也降低了ICAM1和MMP9的表达水平。表明SM和Tan IIA降低了ApoE-/-小鼠血管炎症因子的表达。分子对接模拟结果显示，COX-2 (PTGS2)参与了SM和Tan IIA的抗炎作用。以上数据显示ApoE-/-小鼠主动脉COX-2表达升高，而SM和Tan IIA降低了ApoE-/-小鼠主动脉COX-2表达(图5E和5F)。且SM和Tan IIA通过抑制COX-2、TNF-α和NF-κ b的表达在降低血管炎症反应中发挥了关键作用。
图5 SM和Tan IIA降低ApoE-/-小鼠血管炎症因子的表达
7. Tan IIA通过抑制COX-2表达，降低炎症因子的表达，挽救ox-LDL诱导的HUVECs功能障碍
由于Tan IIA与SM具有相似的抗动脉粥样硬化和抗炎作用，作者使用Tan IIA进一步研究SM在体外抗炎作用中的作用机制。最初，通过增殖检测实验确定Tan IIA干预人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的最佳浓度为25 μg/mL(图6A)。细胞免疫荧光染色显示，ox-LDL培养的HUVECs中COX-2、TNF-α和NF-κB的表达水平高于正常HUVECs，但在细胞中添加Tan IIA后，这种上调表达被抑制(图6B-6D)。此外，在ox-LDL诱导的HUVECs中，Tan IIA阻止NF-κB p65进入细胞核(图6C)。Western blotting实验证实了这些结果。如图6E - 6F所示，Tan IIA降低了ox-LDL诱导的炎症因子的上调表达。
图6 Tan IIA可降低HUVECs中炎症因子的表达
Tan IIA还挽救了ox- LDL引起的细胞迁移和管形成的减少，通过转染COX-2过表达质粒逆转了这一现象(图7A-7E)。Tan IIA降低了ox-LDL培养的HUVECs中NF-κB、TNF-α、ICAM1和MMP9的表达，在添加COX-2过表达质粒后，这种作用被逆转(图7F - 7G)。这些数据表明，Tan IIA抑制COX-2的表达，降低炎症因子的表达，保护细胞免受ox-LDL损伤。
图7 Tan IIA通过抑制COX-2表达，降低炎症因子表达，挽救ox-LDL诱导的HUVECs功能障碍
文章小结
该文章针对中药丹参和AS进行了网络药理学分析，并结合细胞实验和动物实验来提升分析结果的说服力，中间更是利用分子对接、各种网络构建来提高文章的创新性，所以对网络药理学分析感兴趣的小伙伴们还在等什么，赶紧码住这个思路，高分文章就在前面等你，冲就完了！
如果你还苦恼于生信分析没有思路，或者嫌分析方法太过简单、太过老套，想要创新思路，需要复现或了解更多分析思路的朋友欢迎call小云，风里雨里小云等你！
1. 1个月接收的7分+网络药理学！有了干湿结合扛大旗，网药分析文章也相当好发嘛！
2. 新冠和肿瘤还能这么玩？临床医生速来围观，13分+纯生信换个肿瘤又是一篇！
3. 湘雅医院骨科团队，1个月连发2篇1区12分+「孟德尔随机化」!你还在等什么？
4. 4张图拿下12分+纯生信？新方向「病毒感染诊断」发文就是厉害！
5. 这篇7分+纯生信玩出了花！集齐线粒体、18种细胞死亡和10种机器学习算法，审稿人都称绝！
