第1阶段 冷冻
为了在载玻片上准备组织切片，我们必须先冷冻样品，然后进行切片和固定。
所需材料
-样品
-异戊烷
-干冰
-OCT化合物
-组织包埋模具和包埋盒
实验步骤
1.准备冷异戊烷浴。
1.1将干冰装入一个大的绝缘容器中。
1.2用异戊烷填充金属容器并将容器置于干冰上。
1.3等待5分钟，让异戊烷被干冰冷却。
提示：干冰和异戊烷的含量应相同。
异戊烷可能会在容器边缘或底部冻结；不要让异戊烷完全冻结。
2 .将新鲜组织放入包埋模具中，并用OCT化合物填充。同时根据需要调整组织的方向。
3 .使用异戊烷浴冷冻组织。
3.1用镊子将组织模型放在异戊烷浴上10 - 20秒，直到组织块变得不透明。
注意：避免让任何异戊烷接触到OCT化合物。
4.将冷冻组织储存在-80°C下直至准备切片。
第 2 阶段 切片
一旦组织被嵌入，我们就可以将其切成薄片并将其安装到显微镜载玻片上。
所需材料
-冷冻组织样本
-合适的载玻片
-低温恒温器
-低温恒温器刀片
实验步骤
1.将冷冻的组织样本放入低温恒温器中，降至-20°C，过夜。
注意：确保所有使用的工具在切割前都保存在低温恒温器中并降低至同一温度。
2.将冷冻块安装到样品架上。
3.将低温恒温器刀片放入支架中，确保其固定，并按照仪器说明来设置间隙角。
注意：应调整刀片间隙角以实现最佳性能。
4.修剪冷冻组织块，露出组织表面。修整厚度通常为10-30 µm。
5.继续切割厚度为5 - 8 µm的切片。
提示：刚开始切出来的切片可能包含因修剪而造成的孔洞，无法用于后续实验。
6.用刷子收集切片并将其放在载玻片上，以备后续固定步骤。
提示：也可以使用牙签，或者可以稍微抬起切片，并将载玻片正对着切片放置，切皮随后会粘附在载玻片上，注意避免让切片与载玻片边缘接触。
第 3 阶段 固定
这里我们需要风干冷冻样本，然后进行固定，以在抗体孵育之前保存蛋白质和组织形态。
所需材料
-合适的组织切片
-洗涤缓冲液（PBST）
-固定剂（10% NBF 或4% PFA、100%丙酮或甲醇）
实验步骤
1.将冷冻样品在室温下干燥15分钟。
提示：该过程在冷冻、包埋和冷冻样本切片后开始。这与石蜡包埋不同，石蜡包埋是在包埋之前进行固定。
2 .选择合适的室温固定剂。
表 1. IHC中常用的固定剂。
注意： 对于新抗体，我们建议从三个方面入手：
1）4%多聚甲醛
2）100%甲醇
3）丙酮：酒精（甲醇或乙醇）1:1溶液
请注意，10％NBF和4％PFA中的甲醛浓度几乎相同。
3.将组织载玻片浸入固定液中，在室温下孵育样品15分钟。
4.用PBST清洗组织载玻片三次。
注意：对于丙酮固定，在气流下风干30分钟，使其完全干燥。
第 4 阶段 封闭
在IHC中，封闭步骤对于防止图像中的高背景染色尤为重要。
所需材料
-固定好的组织切片
-蛋白质封闭液（例如：2-10%跟二抗为同物种的正常血清，或无血清蛋白块）
-生物素封闭溶液（可选-用于生物素化抗体）
-内源性过氧化物酶封闭液（可选）
-洗涤缓冲液，PBST（PBS, 0.05% Triton X-100）
实验步骤
1.用PBST清洗载玻片两次，每次5分钟。
2.进行内源性亲和素/生物素封闭（可选）。
2.1室温下将载玻片放入亲和素封闭溶液中孵育10分钟。
2.2用PBST清洗载玻片一次。
2.3室温下将载玻片放入生物素封闭溶液中孵育10分钟。
2.4用PBST清洗载玻片一次。
注意： 您应该仅对生物素化抗体执行此步骤。
3 .执行内源过氧化物酶封闭（可选）。
3.1将载玻片与3%过氧化氢在室温下孵育10分钟。
3.2用PBST清洗载玻片一次。
注意： 您应该仅对过氧化物酶偶联的抗体执行此步骤。
4 .执行蛋白质封闭。
4.1将载玻片在蛋白质封闭试剂中室温孵育30 - 60分钟。
注意：您应该对所有IHC实验执行此步骤。
如果使用血清进行封闭，则血清应与二抗的宿主物种相匹配。
封闭溶液不应含有一抗宿主动物血清，否则可能会导致高背景。
5.用PBST清洗载玻片三次，每次5分钟。
6.进行免疫染色。
第 5 阶段 抗体孵育
完成必要的封闭步骤后，我们就可以开始用抗体染色组织了。我们可以使用偶联的一抗直接染色组织，也可以使用偶联的二抗间接染色组织。
多色IHC涉及用两种或多种抗体对细胞进行染色，以显示两种或多种目标蛋白的分布。下面给出的间接和直接方案均适用于多色IHC。我们可以同时用多种抗体组孵育细胞，也可以按顺序用每种抗体组孵育细胞，并在每次孵育之间进行封闭。
【直接染色法】
所需材料
-已进行相关封闭步骤的组织
-抗体稀释缓冲液（PBS + 1％BSA）
-洗涤缓冲液（PBST）
-偶联一抗
实验步骤
1.确定要使用的最佳抗体稀释度，然后用含有1% BSA的PBS稀释抗体。
注意：抗体数据表上通常会建议最佳稀释度。
如果没有，您可能需要进行稀释以找到最佳的抗体浓度。
2.将载玻片放入预先稀释的一抗中孵育 室温下1小时，或在4°C下过夜。
注意：孵化时间可能需要优化。
抗体溶液需要完全覆盖样本。
使用疏水屏障笔可以帮助容纳少量液体。
3.用PBST清洗载玻片三次。
4.继续进行复染、封片和成像。
【间接染色法】
所需材料
-已进行相关封闭步骤的组织
-稀释缓冲液（PBS，1％BSA）
-洗涤缓冲液 （PBST）
-一抗
-偶联二抗
-疏水屏障笔-可选
实验步骤
1.用含有1% BSA的PBS稀释一抗和二抗。
注意：抗体数据表上通常会建议稀释度。
您可能需要进行稀释以找到最佳的抗体浓度。
2.将样本与预先稀释的一抗一起孵育，室温下1 - 2小时，或在4℃下过夜。
注意：孵化时间可能需要优化。
3 .用PBST清洗载玻片3次。
4 .根据制造商的指导，用预稀释的二抗孵育样品。通常，建议在室温下孵育45-60 分钟。
注意：孵化时间可能需要优化。
如果使用荧光团，则必须在黑暗中孵育以避免光漂白。
在添加HRP标记的二抗之前，此时可以进行内源过氧化物酶封闭。
5 .用PBST清洗载玻片3次。
6 .有需要的话继续复染、封固和成像。
第六阶段 检测
用抗体孵育后，您现在可以根据以下步骤对载玻片进行成像。
【比色法】
所需材料
-用酶联抗体染色的组织玻片
-显色底物（HRP 示例：DAB D573235、 AEC A383182）
-复染（可选，例如：Mayer's苏木精H301933）
-安装介质
-密封剂（水性封固剂可选，例如指甲油或柠檬烯）
-盖玻片
-显微镜
实验步骤
1.将载玻片浸入显色底物溶液中。孵育直至观察到所需颜色。
注意：在孵育过程中要目视监测染色情况。
如果需要的话，可以在这里添加AP封闭。
2.用冷流水冲洗载玻片以除去多余的底物。
3.将载玻片浸入复染溶液中（可选）。
3.1按照制造商的指导在室温下进行孵育，或直到观察到所需颜色。
4.用冷流水冲洗载玻片，以除去多余的染色剂并使苏木精变蓝。
5.在使用有机封固剂之前，对组织进行脱水和清洁（可选） 。
5.1在室温下，在 Coplin 罐中手动或在自动嵌入系统中进行以下交换。
6.在载玻片上加入几滴封片剂：让载玻片在室温下静置5分钟。
注意：使用覆盖载玻片所需的最小体积。
7.使用镊子小心地将盖玻片放在载玻片上。
-如果使用水性封固剂，请用柠檬烯或指甲油密封盖玻片。
-如果使用有机封固剂，请让封固剂完全干燥。
注意：小心不要引入任何气泡或扰乱样品。
8.使用显微镜对载玻片进行成像。
注意：如果不立即使用，请将载玻片存放在4°C下。
【荧光法】
所需材料
-用荧光团偶联抗体染色的组织切片
-荧光复染剂（可选，例如： DAPI D106471 ）
-适用于荧光检测的封固剂（例如 F598330 ）
-密封剂（例如M292692 , A598329 ）
-盖玻片
-显微镜
-去离子（DI）水
实验步骤
1.将载玻片浸入复染液中 按照制造商的指导在室温下进行或直到观察到所需的颜色（可选） 。
注意：一些封片剂添加了荧光复染剂，从而无需额外的复染步骤。
2.用冷去离子水清洗载玻片以去除多余的污渍。
3.在载玻片上滴几滴封片剂。然后让载玻片在室温下静置约5分钟。
注意：使用封固切片所需的最小体积。
4.使用镊子小心地将盖玻片放在载玻片上。如果使用水性封固剂，请用柠檬烯或指甲油密封盖玻片。
5.使用显微镜对载玻片进行成像。
注意：如果不立即使用，请将载玻片存放在4°C的黑暗环境中。
