角膜移植難題現，傳統方式缺陷顯，創新水凝膠破局

2024-10-05健康

大家好！今天來了解一篇天然聚合物衍生光固化生物粘附水凝膠研究——【Natural polymer-derived photocurable bioadhesive hydrogels for sutureless keratoplasty】發表於【Bioactive Materials】。本文介紹了一種用於無縫合角膜移植術的天然聚合物衍生光固化生物粘附水凝膠。該水凝膠由明膠甲基丙烯酰基和氧化葡聚糖組成，具有高透光率、抗酶降解和良好化石相容性等優點，為角膜移植提供了新的選擇。一起看看吧！

*本文只做閱讀筆記分享*

一、研究背景

角膜是眼球前部的透明層，對於視力至關重要。然而，各種疾病可能導致角膜瘢痕，進而引起視力障礙甚至失明。角膜移植是治療角膜盲患者視力康復的主要方法，但傳統的縫合方法存在諸多問題，如耗時、需要高超技能以及可能引發多種並行癥，包括感染性角膜炎、無菌性浸潤、角膜新生血管形成和高度散光等。因此，無縫合角膜移植術成為研究熱點。

目前的角膜粘合劑雖然取得了一定進展，但仍然存在不足，如氰基丙烯酸酯有毒性、缺乏透明度和柔韌性，纖維蛋白膠粘附力低等。近年來，粘附性水凝膠在傷口閉合中顯示出有效性，本研究旨在開發一種滿足角膜移植需求的生物粘附水凝膠。

二、實驗方法與結果

（一）材料

購買了GelMA（EFL-GM-60，60%接枝度）、鋰苯基-2,4,6-三甲酰基次膦酸鹽（LAP）、葡聚糖、NaIO4、二甘醇等材料，以及細胞培養相關試劑和檢測試劑盒，如Calceinacetoxymethyl（calceinAM）和ethidiumhomodimer-1LIVE/DEADassaykit、CCK-8assaykit等。

（二）合成ODex和制備生物粘附水凝膠

1、ODex的合成

按照報道方法合成ODex。將2g葡聚糖溶解在水中，濃度為10%（w/v），加入1.6g NaIO4，在室溫下避光攪拌3h，然後加入等莫耳量的二甘醇，反應溶液用去離子水透析3天，最後透過凍幹得到ODex粉末，並測量其氧化程度（OD）。

2、生物粘附水凝膠的制備

將LAP溶解在PBS中，濃度為0.25%（w/v），加熱至55°C確保完全溶解。將GelMA粉末分別以5%、10%和20%（w/v）的濃度溶解在LAP溶液中，然後加入不同量的ODex，形成品質比為GelMA:ODex分別為5:0（G5）、10:0（G10）、20:0（G20）、5:5（G5OD5）、10:5（G10OD5）和20:5（G20OD5）的預水凝膠。預水凝膠在37°C孵育10min形成Schiff堿，然後用405nm可見光（30mW/cm²）光交聯4min形成水凝膠。

（三）效能檢測

1、微觀形態分析

透過掃描電子顯微鏡（SEM，EVO18；Zeiss，Germany）觀察水凝膠的微觀結構。將凍幹樣品固定在鋁制短棒上，噴鍍鉑70s後進行檢測，可以看到隨著GelMA濃度增加和ODex的加入，水凝膠的孔徑減小，結構更加致密。

2、光學性質評估

制備矩形水凝膠（長3cm，寬1cm，厚100μm），測試前將樣品浸泡在PBS溶液（pH=7.4）中1h。使用UV3802紫外-可見分光光度計（ShanghaiUNIC，Shanghai，China）在37°C下測量400-800nm範圍內的光透射率。結果表明，水凝膠在可見光範圍內透光率高於90%，接近天然角膜。

3、含水量測定

將水凝膠浸泡在PBS溶液I（pH=7.4）中，一定時間後取出，用濾紙吸幹表面水分，測量濕樣品重量（ Mt ），根據公式 Wt = ( Mt-M0 )/ M0 ×100%計算膨脹率，其中 M0 為膨脹前的初始重量。結果顯示，隨著GelMA濃度增加和ODex的引入，膨脹率降低。

4、酶抗性檢測

評估水凝膠在膠原酶溶液中的抗降解能力。將約200mg樣品在含有5mM CaCl 2的0.1M Tris-HCl緩沖液（pH7.4）中於37°C平衡1h，然後加入膠原酶溶液，使其終濃度為1mg/mL，每8h更換一次膠原酶溶液。在不同時間間隔取出樣品，稱重，根據公式剩余品質百分比= Wt / W0 ×100%計算剩余品質百分比，其中 W0 為水凝膠的初始重量， Wt 為每個時間點水凝膠的重量。結果表明，水凝膠對膠原酶的抵抗力隨GelMA濃度和ODex的增加而提高，降解時間延長。

5、機械效能測試

制備矩形水凝膠（長3cm，寬1cm，厚100μm），測試前將樣品浸泡在PBS溶液（pH=7.4）中1h，然後用超級膠水將樣品兩端粘在玻璃片上，用單軸載荷測試儀（Model#5567；InstronCorporation，Issaquah，WA，USA）測量拉伸強度、彈性模量和斷裂伸長率，十字頭速度為5mm/min，初始夾頭間距為10mm。結果顯示，G20OD5水凝膠具有最高的拉伸強度、楊氏模量和較好的彈性。

6、體外粘附試驗

剪下粘附強度測試： 測試水凝膠與玻璃之間的剪下粘附強度，並與纖維蛋白膠進行比較。將兩塊玻璃（長7.6cm，寬2.6cm）塗上20%（w/v）的明膠溶液，在37°C下晾幹，然後在兩塊玻璃之間滴加25μL預水凝膠溶液或混合纖維蛋白膠，進行光交聯，測量剪下粘附強度。結果表明，水凝膠的剪下粘附強度隨GelMA濃度和ODex的增加而顯著提高，G20OD5表現出最佳的剪下粘附強度。

體外爆破壓力試驗： 在豬眼上進行體外爆破壓力試驗。從新鮮豬眼中切取角膜鞏膜紐扣，安裝在Barron人工前房上，在中央角膜制作一個4-mm穿透切口，在切口處塗抹15μL預水凝膠，原位交聯4 min，然後將人工前房連線到壓力計和註射器輸液泵，以5mL/h的速度向人工前房註入生理鹽水，測量最大壓力。結果顯示，G20OD5水凝膠的爆破壓力遠高於纖維蛋白膠，能夠承受較高的眼壓。

7、體外細胞研究

細胞培養 ：使用L929細胞（ATCC）和兔角膜成纖維細胞進行細胞研究。L929細胞在含10%胎牛血清（FBS）和1%青黴素/鏈黴素的Dulbecco’smodifiedEagle'smedium（DMEM）中培養，兔角膜成纖維細胞從新鮮紐西蘭兔角膜中分離，在含10%FBS和1%青黴素/鏈黴素的DMEM中培養。

細胞相容性評估 ：

1）二維培養 ：將預水凝膠過濾後加入組織培養板，光交聯，然後將L929細胞接種在水凝膠上，培養2天後更換培養基，用LIVE/DEADassaykit評估細胞活力，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞。結果表明，L929細胞在水凝膠上生長良好，細胞活力高。

2）三維培養 ：將L929細胞重懸在無菌預水凝膠中，加入組織培養板，光交聯形成細胞封裝，培養2天後更換培養基，用CCK-8assaykit評估細胞增殖。結果顯示，細胞在水凝膠中增殖正常。

3）基因表現分析 ：提取兔角膜成纖維細胞的總RNA，用PrimerScriptRTMasterMix合成cDNA，用SYBRGreenSupermix進行qPCR，分析肌成纖維細胞相關基因Collagen1A1、Collagen3A1、FibronectinA1和TGF-β1的表達水平。結果表明，在G20OD5浸出液中培養的細胞未出現過度的肌成纖維細胞轉化。

（四）動物研究

1、手術過程

對8-12周齡的雄性紐西蘭白兔進行板層角膜移植術。在全身麻醉和局部麻醉下，使用6.75mm環鉆在中央宿主角膜進行部份厚度環鉆，手動去除前角膜基質至約2/3深度，用生理鹽水沖洗受體基質床，制備0.25-mm超大的供體角膜透鏡，在受體基質床上塗抹約25μL暫時制備的預水凝膠，將供體透鏡轉移到受體床上，調整位置後進行光聚合，術後給動物佩戴伊莉莎白項圈，並每天使用0.3%妥布黴素眼膏一次，持續一周。

2、術後評估

裂隙燈、AS-OCT和共聚焦顯微鏡評估 ：每周使用裂隙燈生物顯微鏡評估移植片附著、角膜透明度和其他病理變化，使用熒光素染色評估角膜上皮缺損，用光譜域AS-OCT獲取角膜組織的橫截面影像評估移植片附著，在全身麻醉下使用體內共聚焦顯微鏡評估角膜細胞變化和炎癥狀態。結果顯示，術後角膜保持透明，移植片附著良好，上皮細胞快速再生。