鈺芯微電極@用於DNA檢測的POCT微流控器件

2024-01-27健康

醫學診斷技術在疾病的診斷、治療和預防中發揮著非常重要的作用。隨著疾病相關的生物標誌物檢測策略的不斷發展，基於DNA的生物傳感器因為能夠靶向人類、病毒和細菌的遺傳資訊而在臨床診斷中受到越來越多的重視。

與此同時，因為具有改善患者治療效果的潛力（例如降低醫療成本、縮短診斷周期、提高醫療服務獲取的便利性等），即時診斷技術（POCT）在過去幾年中獲得了極大的關註。

然而，雖然現有的用於POCT的DNA生物傳感器具有良好的套用前景，但是，其仍然存在某些局限性。首先，利用現有的DNA生物傳感器進行DNA檢測涉及多個步驟，例如樣品制備、擴增和檢測，並且這些步驟是分開進行的。

因此，一方面，操作的復雜性需要訓練有素的人員；另一方面，系統有效執行的空間需求對其可及性提出了挑戰，特別是在現場套用的情境下。更重要的是，由於在套用過程中需要昂貴的試劑和材料，其成本因素仍然是一個主要障礙。

DNA傳感平台

近期，來自南韓西江大學的研究人員在知名期刊 Advanced NanoBiomed Research 上發表了題為「Point-of-Care Testing (POCT) Devices for DNA Detection: A Comprehensive Review」的綜述，概述了整合DNA生物傳感器的芯片實驗室技術在POCT領域的發展現狀。

傳感平台的選擇是POCT工具開發的一個基本點。傳感平台應具有便攜性、使用者友好性和易於操作性；此外，平台還應堅固、靈活和耐用。在選擇DNA檢測平台作為POCT工具時，該平台應與強大的分析方法相容，以期用最少的樣本得到快速準確的結果。到目前為止，世界各國的研究人員已經成功開發了幾個平台，作為DNA分析中POCT套用的工具。

微流控芯片、紙基微流控裝置和側流分析（LFA）平台被認為是POCT工具的常用選擇。因此，選擇平台時應根據每個應用程式中DNA檢測的具體需求，透過評估目標、檢測過程和測試環境，同時仔細考慮分析的目的，來選擇合適的DNA傳感平台。

微流控器件

微流控技術專註於使用高達數百微米規模的通道進行小規模流體的行為、操作和控制，然後發展成為一種可用於進行各種反應、分離和檢測的技術。一開始，微流體裝置可以用矽和玻璃基板制造，後來發展成各種選擇，如陶瓷、聚合物和紙張。這些襯底材料可以透過各種方法，如層壓、成型、3D打印和奈米制造，進一步成為器件。

泄漏是微流控裝置的主要問題之一，可以根據具體的套用要求透過熱粘合、粘合劑粘合、幹粘合或溶劑粘合來解決這個問題。

微流控器件已經成為開發生物傳感器的強大工具，特別是在POCT套用中。微流體通道的微尺度尺寸能夠精確控制流體的流動，從而實作分析物檢測的高靈敏度和特異性。對於核酸檢測，微流體系統經常將微流體、核酸純化和擴增以及檢測方法的原理整合到單個裝置中，從而實作復雜測定的自動化和小型化。

微流控器件的每個功能部件和流量控制單元，如流量傳輸、計量、閥門和開關，都必須表現出卓越和穩健的效能。在所有種類的微流體系統中，毛細管和離心力已被確定為核酸檢測的極好選擇，因為它們具有多功能的流體控制，不需要復雜的管路或微閥，使它們成為整合核酸和核酸的理想選擇。

離心微流體技術是臨床樣本護理點醫學測試的一種很有前途的選擇，它包括各種步驟，如制備、培養、洗滌等。對於離心式微流體裝置，所有這些步驟都可以在單個旋轉盤上進行，在該旋轉盤中，樣品溶液透過產生的旋轉力驅動透過微通道。離心力使流體移動，分離顆粒，混合試劑，並執行其他流體操作。

一個來自中國的科研團隊開發了一種新的離心微流體平台，用於從全血樣本中檢測B型肝炎病毒的DNA。該平台由一個使用聚甲基丙烯酸甲酯作為基底制成的微流體盤組成，旨在實作一個高效的系統，該系統包括樣品制備和分離、裂解、DNA提取和DNA擴增，這是一個與熒光檢測器整合的全自動、樣品到檢測結果的過程。

*用於從全血樣品中檢測B型肝炎病毒DNA的離心式微流體平台的示意圖

利用毛細管力的系統是微流體中最廣泛使用的系統之一，為有效的流體調節提供了一種成功的被動驅動微泵送方法。另一個研究團隊研發了一種被動驅動的微流體裝置的開發，該裝置用於透過環介導的等溫擴增分析檢測核酸，並在熒光顯微鏡下同時監測。

該系統中使用的微流體芯片沒有泵和閥，並允許使用者透過微量移液管調節在納升規模上控制液滴。采用聚二甲基矽氧烷矽片刻蝕光刻技術制作了微流控平台。毛細管通道和閥門的設計在控制該系統中的流體流動方面起著至關重要的作用，允許流體的保留或透過。

*用於透過環介導等溫擴增測定檢測核酸的被動驅動微流體裝置的示意圖

側流分析法

通常，側流分析法（LFA）是一種基於免疫測定原理的簡單快速的診斷測試。這種測定法也被稱為側流免疫測定法或條帶測定法，是醫療診斷、食品安全和環境監測等各種套用中檢測目標分子的一種簡單且經濟高效的方法。LFA通常設計為條形配置，由樣品墊、結合墊、硝化纖維膜和吸收墊組成。LFA的基本原理是毛細管驅動的流體流動透過多孔NC膜，穿過條帶的不同區域，沿途與特定的檢測元件交互作用。

LFA中的核酸直接檢測方法包括將核酸探針固定在測試和/或控制區中，這將捕獲核酸靶標。互補探針通常使用鏈親和素-生物素結合到NC膜上固定。Henderson等研究人員提出了一個例子，他們改進了LFA，使用23S rDNA–AuNP綴合的探針從人類糞便中檢測大腸桿菌的DNA和RNA。

*側流分析（LFAs）中核酸直接檢測人類糞便中大腸桿菌的示意圖

紙基微流控器件

基於紙張的裝置由於其簡單、便攜和快速檢測的特性而獲得了極大的關註。該平台因其價格合理、簡單且具有成本效益的技術而得到迅速發展。這種器件是基於紙張多孔的毛細管作用，這使它們非常適合用作2D微流體紙基裝置，並添加疏水屏障來建立通道。此外，將多個紙層堆疊到3D微流體紙基裝置中可能與更先進的功能整合。

Teengam等科研人員使用蒽醌標記的吡咯烷基肽核酸誘導的銀奈米粒子聚集，開發了一種用於同時檢測中東呼吸症候群冠狀病毒、結核分枝桿菌和人乳頭瘤病毒寡核苷酸的紙基比色DNA傳感器。他們將蠟圖案打印到Whatman 1級濾紙中以建立通道，並基於包括兩層紙的折紙平台制作傳感器。

該傳感器利用靶寡核苷酸與PNA探針功能化的金奈米粒子的特異性雜交以及AgNPs在靶寡核苷酸存在下的聚集。聚集導致肉眼可見的顏色變化，提供了一種簡單且低成本的檢測方法。

*用於中東呼吸症候群冠狀病毒、結核分枝桿菌和人乳頭瘤病毒寡核苷酸檢測的紙基比色裝置

紙基DNA傳感器的另一種方法是使用電化學檢測。電極透過各種技術在紙基板上制造，如絲網印刷法或噴墨印刷法。靶DNA將被固定在電極表面的探針捕獲，導致電化學反應的變化，可以透過電化學技術測量。

Cinti等科研人員建立了一種紙基電化學生物傳感器，用於使用絲網印刷碳電極檢測單鏈和雙鏈DNA。該傳感器使用濾紙和影印紙作為基底，產生了易於圖案化的表面，具有成本低和納莫耳範圍內核酸的高檢測率。

*用於單鏈和雙鏈DNA檢測的電化學紙基平台制造方法示意圖

DNA分析探針

影響DNA檢測選擇性的一個重要因素是探針的選擇。探針是用於分析特定DNA序列的重要工具。根據沃森-克瑞克堿基配對規則，DNA檢測的基本原理通常依賴於DNA/RNA靶標與其互補探針之間的特異性雜交。探針的設計對DNA傳感器的有效性起著至關重要的作用，因為它必須能夠以高準確性和特異性與所需的DNA序列雜交。

DNA探針的固定化是開發DNA生物傳感器以選擇性捕獲其互補靶DNA的關鍵步驟。固定化程式的選擇取決於基質的性質、探針和套用要求。此外，固定化程式應提供高反應性和可及性、良好的定向和較少的非特異性結合。

*DNA探針

作為最簡單的方法，吸附被認為是固定DNA探針的直接策略之一。用於固定DNA生物傳感器中的DNA探針的方法通常被稱為物理吸附。通常，使用帶正電的材料（如殼聚糖）或陽離子聚合物（如聚苯胺和聚吡咯）對基材進行改性。帶有負電荷的DNA探針透過靜電交互作用物理吸附在基底表面。值得註意的是，即使在受質上沒有正電荷的情況下，由於範德華交互作用，DNA片段也表現出結合親和力。當DNA和受質接近時，這些交互作用產生於瞬間的電子雲極化，從而產生吸重力。

研究人員Teengam開發了一個基於吸附的DNA固定化的例子，制備了G-PANI修飾的電極。PANI結構上胺基的正電荷有利於透過靜電交互作用固定帶負電荷的探針。盡管該方法簡單，但仍存在非特異性吸收和隨機探針取向的問題，這可能會影響雜交效率和檢測靈敏度。

*基於靜電吸附的DNA探針

另一種有效的固定化策略是基於共價鍵。通常，DNA探針在3'或5'端用胺（Np）或硫醇（SH）修飾。這些官能團可以與受質表面的特定官能團共價結合。該方法表現出顯著的優點，如高度特異性結合、優異的穩定性、靈活性和低非特異性吸附。各種共價反應已被廣泛用於DNA探針的固定化。

Np封端的DNA探針通常用於固定含有羧基、醛基、環氧基和異硫氰酸酯基團的受質。碳二亞胺試劑經常用作該共價偶聯反應中的交聯劑。

*不同功能化基團修飾受質上的Np末端DNA探針

檢測方法

實際上，人們已經開發出用於DNA檢測的小型化平台來執行可存取的功能，例如多個步驟或自動化處理，以獲得更好的效能，仍然需要適當的檢測分析來與它們合作。

最近，幾種分析方法已成功地用於基於微型化的DNA分析。其中比色法和電化學檢測是最常見的檢測技術。

比色法

比色檢測以其簡單、快速、經濟的優點在DNA芯片上得到了廣泛的套用。該方法包括在目標分析物存在的情況下觀察顏色深度或顏色強度的變化，展示定性或定量資訊。顏色變化可以用肉眼目視觀察，也可以用分光光度計或色度計等儀器測量。基於幾種傳感原理，已經開發了大量的比色檢測裝置。

Tsai提出了一種使用AuNPs進行結核病診斷的紙基比色平台。該平台中DNA探針和TB靶DNA之間的雜交誘導了奈米顆粒表面電荷密度的變化，導致奈米顆粒的聚集。為了獲得快速的現場分析，透過蠟印技術制造了紙基裝置，以獲得測試點。將樣品溶液點在裝置上，然後測量顏色強度。

*擬議的基於紙張的結核病檢測裝置示意圖

另一個已經成功研發的引人註目的設計是折紙紙基分析裝置（oPAD）。oPAD是透過折疊成所需的配置來制造的，該配置可能進行多個載入位點、多步驟和用於比色DNA分析的多重檢測。該裝置被制造成在單個裝置內執行三個主要步驟：DNA純化、DNA擴增和比色檢測。oPAD分為兩個主要部份。第一部份是分裂墊，第二部份由純化/反應、染料和芯吸墊組成。這兩個部件透過密封膜組裝，以獲得完整的oPAD。

操作時，將分離墊向純化墊折疊，同時將芯吸墊折疊在其下方。將預處理過的樣品載入到分離墊中，並流向塗有殼聚糖的純化墊，用於純化過程。之後，將純化墊向裝載LAMP試劑的反應墊折疊。然後將該裝置加熱至65°C持續30分鐘，用於透過LAMP反應進行擴增步驟。LAMP產物包含在反應墊中。隨後，載入漂白溶液，然後將染料墊折疊到反應墊上。最後，可以在視覺上觀察到染料墊上的藍色，對應於目標濃度。整個過程在1–2小時內成功執行。所提出的裝置顯示出簡單、便攜和可負擔性，在醫療診斷和公共衛生領域具有潛在套用，特別是在低資源環境中。

*折紙紙基分析裝置（oPAD）的組成和使用方法示意圖

電化學檢測法

電化學檢測作為一種非常有前途的靈敏檢測感興趣DNA的方法，已經得到了廣泛的認可。電化學DNA檢測的傳感原理主要取決於靶DNA與其互補探針之間的雜交，從而導致訊號的變化，如電阻或電化學電流。

一種電化學DNA傳感器傳感策略通常基於標記系統。這種方法需要捕獲探針或訊號探針，用電活性分子或指示劑直接標記以產生可檢測的訊號。探針上標記的氧化還原分子和電極表面之間的變化距離在雜交時發生變化，導致電流響應發生變化。訊號探針是指可以在三明治型平台或與靶DNA競爭性結合中使用的額外核酸序列。

Teengam等學者提出了一種用於檢測HPV的紙基電化學DNA傳感器。透過蠟印刷技術形成疏水屏障，然後使用絲網印刷方法在紙基材上制造電極。用G-PANI修飾工作電極，透過靜電交互作用固定acpcPNA探針。在存在HPV靶DNA的情況下，由於PNA/DNA雙鏈體的剛性，電化學訊號與靶濃度成比例降低，從而提供了從AQ進行電子轉移的不可接近性。

*在電極上修飾的石墨烯-聚苯胺復合物和固定化和雜交程式的示意圖

然而，對感興趣的DNA的電化學測量可能需要多個步驟，包括樣品和試劑引入步驟、洗滌步驟和測量步驟，導致使用者必須不可避免地以順序方式或一步操作提供試劑/樣品。出於這個原因，已經成功地建立了大量的幾種DNA芯片設計來解決這些問題。在Srisomwat的工作中，彈出式折紙結構被設計為與HBV DNA的電化學檢測相結合。

彈出裝置的設計采用蠟染法在Whatman 1號濾紙基材上進行圖案化。特征設計是試劑區和檢測區的臨分時離制造，這可以防止每個步驟中發生汙染。在樣品區，用於HBV的acpcPNA探針固定在樣品區中，其中工作電極在裝置的背面。將樣品溶液添加到裝置開放階段的樣品區，使探針和靶DNA完全雜交。

*彈出式DNA裝置的示意圖

電泳技術

電泳是一種用於根據蛋白質、抗體和核酸等生物分子的大小和電場下的電荷來分離和分析它們的技術。它優於其他檢測方法，因為它能夠將分子混合物分離成特定成分，從而進行更精確的辨識。相反，電泳需要外部電源、長期操作和專業知識。

電泳通常使用支持介質，例如凝膠或非凝膠組合物來穩定載體電解質。然而，眾所周知，這些傳統的電泳方法體積大、價格昂貴且耗時，因此需要開發微芯片電泳技術，為POCT套用提供了快速效能、低樣品和試劑消耗以及小型化尺寸等優勢。

*微芯片電泳原理及其工作過程示意圖

具有不同物理和化學性質的幾種型別的紙基材被用於不同的套用。纖維素層析紙被用於在電泳技術中使用長雙鏈RNA（dsRNA）作為病毒標記物的傳染病快速篩查。這種方法利用微米和奈米級纖維素孔在紙張微流體通道中的外部電場下對不同尺寸的RNA進行分類。紙質CE芯片可以有效分離出濃度接近感染細胞的長dsRNA，為POCT水平的超快病毒疾病檢測提供了一個新平台。

*用於電泳分離病毒長雙鏈RNA的紙微流體芯片

未來展望

DNA是遺傳資訊的載體，為醫學診斷相關問題提供答案。在成本效益高、操作簡單和人員攜行式診斷平台的願景的驅動下，透過整合芯片上實驗室技術，POCT在現代醫療系統中越來越突出。透過巧妙地設計微流體裝置，從樣品到結果的多個步驟，包括DNA提取、探針雜交和檢測，現在可以在微型平台上操作。為了應對低成本、簡單性和便攜性的挑戰，已經引入了幾類微流體裝置。提供無泵輸送功能的微流體裝置，如離心和毛細管驅動系統來驅動流體流動，已顯示出在護理點條件下開發DNA芯片的巨大永續性。

DNA芯片的令人興奮的挑戰是將其與強大的技術相結合，旨在實作有效的訊號轉譯和最低的檢測極限。必須在保持良好的靈敏度和利用為未經培訓的使用者提供低成本、便攜性和易於操作的檢測技術之間找到平衡。光學檢測和電化學技術有望在未來的DNA芯片研究中發揮重要作用。這些技術由於與手持裝置的相容性而特別有利。透過利用先進的光學技術和電化學訊號放大，可以以高精度和高精度在低豐度水平下檢測DNA靶點。隨著分子診斷POCT的不斷發展，下一代DNA芯片將有越來越多的研究工作將樣品制備納入芯片系統。